ゼブラフィッシュTol2遺伝子発現ベクター

概要

当社のTol2ベクターシステムは宿主細胞ゲノムへの高効率な外来性DNA配列の挿入を可能にします。エレクトロポレーションなどの遺伝子導入法による、目的の遺伝子を宿主ゲノムへ挿入する簡便なシステムです。

当システムはミナミメダカ(Oryzias latipes)由来のTol2トランスポゾンを基に開発されています。配列の相同性からTol2トランスポゾンは脊椎動物ゲノムに幅広く保存されているhATファミリーの非自律型トランスポゾンに近いことが分かっています。

Tol2ベクターシステムはE.coliプラスミドとして設計された2つのベクターから構成されます。ひとつめはヘルパープラスミドと呼ばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、2つのITR(inverted terminal repeats)が転移されるDNA配列を挟み込むかたちで配置されています。宿主細胞へ導入予定の遺伝子はトランスポゾンプラスミドのITRのあいだにクローニングされます。

トランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドが宿主細胞へ同時に導入されると、ヘルパープラスミドからトランスポザーセが発現してトランスポゾンプラスミドの2つのITRを認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入します。特定の挿入配列をもつトランスポゾン(例えばpiggyBacトランスポゾンはTTAA配列に挿入が起こる)とはことなり、Tol2トランスポゾンは挿入場所に明確なバイアスはありません。

Tol2はクラスIIトランスポゾンであり、カット&ペースト様式(転移後に自身のコピーを残さない)で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー&ペースト様式をとります。Tol2トランスポゾンによる挿入サイトの両脇には8bpのダイレクトリピートが作り出されます。

トランスポゼースを標的細胞に導入する方法は2つあります。ひとつはヘルパープラスミドを一過的に細胞に導入して短時間だけトランスポゼースを発現させる方法と、もうひとつは標的細胞にヘルパープラスミドからのin vitro転写反応によって生成されたTol2 mRNAを注入する方法があります。どちらを選択しても、トランスポゼースは短時間のみ発現されます。ヘルパープラスミドの宿主細胞からの消失及びトランスポゼースmRNAの分解によってゲノムへ挿入されたトランスポゾンは恒久的に固定化されます。もしTol2トランスポゼースを細胞に再導入すると、ゲノムに挿入されたトランスポゾンは転移することがあります。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Genome Biol. 8(Suppl 1): S7 (2007) Review of Tol2 vectors.
Genetics 174: 639 (2006) Identification of minimal sequences for Tol2 transposable elements.
PLoS Genetics 2: e169 (2006) Large cargo-capacity transposition with a minimal Tol2 transposon.

特徴

当社のTol2トランスポゾンベクターシステムは11kbまでのDNA配列を標的細胞のゲノムに高効率で挿入できます。Tol2トランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドはE.coliでの高コピー数複製、広範囲な細胞タイプへの高効率な導入、導入した遺伝子の高レベル発現を実現します。

メリット

恒久的なベクターDNAの挿入: 従来の形質転換法では宿主細胞へのDNAの導入はDNAの時間経過による減少のために一過的なものでした。この問題は増殖の速い細胞では特に顕著になります。一方で、Tol2トランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミド(もしくはTol2 mRNA)による形質転換法は遺伝子を宿主細胞へ恒久的に導入できます。

簡便さ: ウイルス作製などが必要なウイルスベクターよりもプラスミドベクターによる遺伝子導入ははるかに簡便です。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のTol2トランスポゾンベクターは全体で~11kbのDNA配列を扱うことができます。プラスミドのバックボーンとトランスポゾン関連の配列はおよそ3kbを占めるだけなので、残りを任意の実験目的に使用できます。

デメリット

使用できる細胞タイプが限定される:Tol2ベクターはエレクトロポレーション法などを使用して細胞を形質転換します。細胞タイプによって形質転換効率は大きく異なるので、Tol2システムを利用できる細胞タイプは限定されます。一般的に非増殖細胞は増殖細胞よりも形質転換効率は低く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも形質転換が困難です。神経細胞や脾臓β細胞などの形質転換は非常に難しくなります。

基本コンポーネント

5' ITR: Tol2 5' inverted terminal repeats。Tol2トランスポゼースは2つのITRを認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

Promoter: 下流の遺伝子の発現させるためのプロモーターが配置される。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 目的遺伝子のORFをここに配置する。

SV40 late pA: SV40(Simian virus 40)のlateポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写停止を助ける。

3' ITR: Tol2 3' inverted terminal repeats。Tol2トランスポゼースは2つのITRを認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。