Tol2 FLEX(Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクター

Tol2 FLEX(Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクターはベクタービルダー社の高効率なTol2ベクターシステムとCre応答性FLEX条件的遺伝子発現システムを組み合わせています。それによってプラスミドベクターを利用した遺伝子導入法によるCre応答性FLEXスイッチの宿主細胞ゲノムへの恒久的な挿入を可能にします。FLEX(Cre-Off)システムは2ペアのLoxPバリアント組み換え配列を目的遺伝子の両側に配置してCre応答性の遺伝子方向の反転によって目的遺伝子の発現を強力に不活性化します。

FLEX (Cre-Off)スイッチは2ペアのLoxPバリアント（オリジナルのLoxPと変異が導入されたLox2272）組み換え配列から構成されています。プロモーターに対して順向き（センス方向）にクローニングされた遺伝子の両側にLoxPペアとLox2272ペアの片側がひとつずつ配置されています。LoxPとLox2272はLox2272‐LoxPの順番で、アンチパラレル配向で配置されます。どちらのLoxPバリアントもCreに認識されますが、同じLoxP配列間でだけ組み換えが発生します。Cre非存在条件では使用するプロモーター活性にしたがって遺伝子が発現されます。Cre存在条件では、まずLoxPペアもしくはLox2272ペアのどちらか一方で起こった組み換えによって遺伝子のアンチセンス方向への反転が起こります。遺伝子の反転によって目的遺伝子の発現は完全に抑制されます。続いて、残り一方のペアに組み換えが起こることによってLoxPペアとLox2272ペアの片側が取り除かれます。この結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272配列がひとつずつ配置され、Cre存在条件でもこれ以上の組み換え反応が起こることはありません。

Tol2ベクターシステムはプラスミドベクターによって目的遺伝子を宿主細胞ゲノムに恒久的に導入できる、非ウイルス性の簡便なシステムです。Tol2 FLEX(Cre-Oｆｆ)条件的遺伝子発現システムは2つのベクターから構成されます。ひとつめはヘルパープラスミドと呼ばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、２つのITR（inverted terminal repeats）のあいだに挿入予定DNA配列が組み込まれます。FLEX(Cre-Off)スイッチはITRのあいだにクローニングされます。トランスポゼースとトランスポゾンプラスミドが目的細胞に同時にデリバリーされると、配列挿入の際にTol2トランスポゼースは配列挿入サイトの両端に相同な8塩基長の反復配列を生み出します。その他のトランスポゾンシステムとは異なり、配列挿入箇所に特段のバイアスはありません。piggyBacトランスポゾンを例にすると、TTAA配列を含む部位が挿入の標的となります。Creの存在下でCre-LoxPによる遺伝子配列の反転により遺伝子発現が活性化されます。トランスポゼースは、1）一過的なヘルパープラスミドのトランスフェクションもしくは、２）IVT (in vitro transcribed) mRNAを目的細胞へマイクロインジェクションする、2通りの方法でトランスポゾンを目的細胞にデリバリーできます。どちらの方法でも、トランスポゼースは短い間のみ発現します。ヘルパープラスミドの消失もしくはTol2トランスポゼースmRNAの分解によってゲノムに挿入されたトランスポゾンは安定化します。

Tol2は、カット＆ペースト型のクラスIIトランスポゾンに分類され、自己コピーを残さずに転移します（クラスIトランスポゾンは、コピー＆ペースト型で、自己コピーを残して転移します）。Tol2ヘルパープラスミドを再び導入することにより、ゲノムに痕跡を残すことなくTol2トランスポゾンを取り除くことができます。その際には痕跡を残さない場合と、欠失が生じる場合があります。

当ベクターシステムは培養組織細胞に利用することができますが、トランスジェニック動物の作製に特に適しています。当ベクターが導入されたトランスジェニック動物個体と組織特異的にCreを発現する個体を交配することで、Creとベクターの両方を受け継いだ子孫が生まれ、Creが発現している組織細胞において遺伝子発現が部位特異的に不活性化されます。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

Tol2 FLEX(Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクターは哺乳類細胞と生体でCreを利用した条件的遺伝子発現を可能にします。初期状態では目的遺伝子は使用するプロモーターの活性制御にしたがって発現します。しかしCreレコンビナーゼの共発現によって遺伝子の向きの反転が起こり、発現が恒久的に不活性化されます。

Tol2 FLEX(Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクターとヘルパープラスミドはE.coliでの高コピー数複製、広範な標的細胞へ高効率なベクター導入および高レベルの遺伝子発現を可能にします。

厳密な遺伝子発現切り替え：Creによる組み換え反応よって目的遺伝子がアンチセンス方向へ反転するため、目的遺伝子の発現を完全に抑制します。

安定した遺伝子不活性化: Cre組み換え反応は目的遺伝子をプロモーターに対してアンチセンス方向に反転します。遺伝子の反転後に続いて起こる組み換え反応によって、LoxPバリアントペアのそれぞれ片側が取り除かれます。結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272がひとつずつ配置される形になり、Cre存在条件でもこれ以上の組み換え反応が起こることはありません。その結果として遺伝子発現の不活性化状態は恒久的に維持されます。

恒久的なベクターDNAの挿入： 従来の方法で宿主細胞へ導入されたベクターDNAはほとんどが時間経過とともに失われます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。Tol2トランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドを使用した遺伝子導入法ならば、トランスポゾンを利用したベクターDNAの宿主ゲノムへの挿入によって恒久的な目的遺伝子の導入が可能です。

簡便さ：プラスミドベクターは従来の方法によって細胞に導入されます。パッケージング操作が必要なウイルスと比べると非常に簡便です。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のPiggyBac FLEX(Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクターは全体で~30kbのDNA配列を扱うことができます。当ベクターのバックボーン部分（トランスポゾン関連、およびCreレコンビナーゼ関連）は３.1kbほどですので、残りを任意の目的で使用することができます。

細胞タイプが限定される：Tol2ベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。一般的に非増殖細胞は増殖細胞よりも導入効率が悪くなり、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。これらの細胞タイプによる限定はTol2システムにも当てはまります。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。Tol2トランスポゼースは2つのITR（5' ITR と3' ITR ）を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

Promoter: 目的遺伝子を発現するプロモーター。

Lox2272: Creレコンビナーゼの組み換え配列。LoxP配列に二か所の塩基置換が導入されている。LoxP配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

LoxP: Creレコンビナーゼの組み換え配列。Lox2272配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 発現させたい目的遺伝子。プロモーターの極性方向に対して順向きに配置される。

SV40 late pA: SV40（Simian virus 40）のlateポリアデニレーションシグナル。目的遺伝子の転写を停止する。

3' ITR: Tol2 3' terminal repeat.

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。