アデノ随伴ウイルス（AAV）パッケージング
アデノ随伴ウイルス（Adeno-associated virus ：AAV) は、in vitroとin vivoの両系で遺伝子導入に使えるため、広範なアプリケーションに一般的に使用されているウイルスベクターです。 AAVは多彩な種類の哺乳類動物由来細胞に遺伝子導入が行え、宿主生物内で病原性が低いことから、遺伝子治療用として最も有効なベクターとして期待されています。VectorBuilderは独自に開発した技術と試薬を用い、ウイルスのタイター、純度、生存率、均一性に優れたAAVパッケージングプロトコールを開発しました。ユーザ―満足度の高さは、VectorBuilderのグローバルユーザーの高いリピート率に現れています。
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AAVの種類
第二世代のAAVパッケージング*
ssAAV (single-stranded AAV) と scAAV (self-complementary AAV)の両方に対応
セロタイプ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6.2, 7, 8, 9, rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8
表1：AAVセロタイプと組織指向性の対応表
| セロタイプ | 組織指向性 |
|---|---|
| AAV1 | Smooth muscle, CNS, lung, retina, inner ear, pancreas, heart, liver |
| AAV2 | Smooth muscle, CNS, liver, kidney, retina, inner ear |
| AAV3 | Smooth muscle, liver, lung |
| AAV4 | CNS, retina, lung, kidney |
| AAV5 | Smooth muscle, CNS, lung, retina |
| AAV6 | Smooth muscle, heart, lung, adipose, liver |
| AAV6.2 | Lung, liver, inner ear |
| AAV7 | Smooth muscle, retina, CNS, liver |
| AAV8 | Smooth muscle, CNS, retina, inner ear, liver, pancreas, heart, kidney, adipose |
| AAV9 | Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, inner ear, testes, kidney |
| AAVrh10 | Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney |
| AAV-DJ | Liver, heart, kidney, spleen |
| AAV-DJ/8 | Liver, brain, spleen |
| AAV-PHP.eB | CNS |
| AAV-PHP.S | PNS |
| AAV2-retro | Spinal nerves |
| AAV2-QuadYF | Endothelial cell |
| AAV2.7m8 | Retina, inner ear |
| 組織 | 推薦する AAV セロタイプ |
|---|---|
| Smooth muscle | AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
| CNS | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-PHP.eB |
| PNS | AAV-PHP.S |
| Brain | AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8 |
| Retina | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2.7m8 |
| Inner ear | AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8 |
| Lung | AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAVrh10 |
| Liver | AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| Pancreas | AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
| Heart | AAV1,AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ |
| Kidney | AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| Adipose | AAV6, AAV8, AAV9 |
| Testes | AAV2, AAV9 |
| Spleen | AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| Spinal nerves | AAV2-retro |
| Endothelial cells | AAV2-QuadYF |
* 注：ご希望の遺伝子をクローニングしたトランスファーベクターの５’と３’の ITRシークエンスは AAV2 ITR由来シークエンスを使っています。弊社でいうセロタイプの違いは、キャプシッドタンパク質のタイプを指しています。
価格と出荷までの作業日数
VectorBuilderのAAVウイルスパッケージングサービスは、数々の自社技術改良を経て、業界でトップ品質の製品を、競合他社に比べて早い納期とリーズナブルな価格で提供しています。（大容量以上のウイルスの受託作製、または高純度ウイルス作製のご依頼は、デザインリクエストを送る、からご連絡ください。）
表2：カスタムウイルス仕様
| サイズ | 推奨する使用系 | タイター＊と仕様 | 平均的タイター** | 価格(税抜き) | 作業日数*** |
| パイロット | 培養細胞 | >2.0x1011 GC/ml, 10x25 ul, PBS buffer | >1012GC/ml | 66,000円 | 10-20 営業日 |
| 中容量 | 培養細胞 | >2.0x1011 GC/ml, 10x100 ul, PBS buffer | >1012GC/ml | 85,500円 | 10-20 営業日 |
| 大容量 | 培養細胞 | >2.0x1012 GC/ml, 10x100 ul, PBS buffer | >5.0x1012GC/ml | 144,000円 | 10-20 営業日 |
| 超純粋パイロット | 培養細胞と in vivo | >1013 GC/ml, 4x25 ul, PBS buffer | >2.0x1013GC/ml | 163,500円 | 20-30 営業日 |
| 超純粋中容量 | 培養細胞と in vivo | >1013 GC/ml, 10x50 ul, PBS buffer | >2.0x1013GC/ml | 229,000円 | 20-30 営業日 |
| 超純粋大容量 | 培養細胞と in vivo | >1013 GC/ml, 10x100 ul, PBS buffer | >2.0x1013GC/ml | 345,500円 | 20-30 営業日 |
GC=Genome copy
* ウイルスタイター保証について：VectorBuilderで受託構築したウイルスベクターからウイルスパッケージングの受注で、かつパッケージングされる5’ ITR から3’ ITRの領域の長さが4.7 kb 以下の場合、タイター保証をご提供しています。
以下の場合、タイター保証は適用外となっています。
- セロタイプ６、セロタイプDJ/8のパッケージングの場合:他のセロタイプに比べて３０－５０％のタイターとなります。ご了承ください。
- パッケージング上限サイズを超えた場合（5’ ITR から3’ ITRの領域の長さが4.7 kb以上）：上限サイズを超えるとウイルスは不安定となり、パッケージされたDNAフラグメントにリアレンジメントやDNA欠損などが生じることが広く知られています。ウイルス粒子へのパッケージングは可能ですが、搭載した遺伝子の機能欠損やタイターの極端な低下が生じることが知られています。
- ベクターに搭載されたORFがパッケージング過程に負の営業を及ぼす場合：例えば、細胞毒性を持つproapoptotic遺伝子群、細胞凝集を誘引する膜タンパク質シークエンス、パッケージング細胞またはウイルスの生合成に負の影響を生じる遺伝子、反復シークエンスや高GCリッチシークエンスなど、ベクタークローニングの際にリアレンジメントや二次構造を生じる可能性の高いシークエンスを含むベクターなどです。
- ユーザーご提供の transfer (cis-)プラスミドDNAを使うウイルスパッケージングのご注文の場合：DNAのシークエンスが非開示の場合、またはITRシークエンスが非定型の場合、高タイターパッケージングには不確定要素が多いため、保証には限界があります。
- ユーザーご提供のpRep-CapプラスミドDNAや、pHelperプラスミドDNAを使うウイルスパッケージングのご注文の場合：弊社のウイルスパッケージングプロトコールは、弊社のベクター構築用のコンポーネントやベクターバックボーンに対して最適化を行っているため、ユーザー提供のウイルスベクターからの高タイターパッケージングには不確定要素が多いため、保証には限界があります。
その他、お見積りの際に弊社よりご連絡させていただいたタイターリスクをユーザーにご同意いただき、パッケージングを受注させていただいた場合、できる限り高タイターでの納品を心がけますが、分子生物学的に無理な場合もございます。ご了承ください。パッケージングの進捗に関しては弊社にメールでお問合せください。
** 平均的タイターは弊社で製造したウイルスの>70%が到達できるタイターを示しています。
*** 出荷までの作業日数は、ご注文いただいた受託サービスが弊社で受注され、製造が完了し出荷されるまでの期間です。ユーザーご提供のウイルスcis-plasmid DNAを使って受託ウイルスパッケージングを受注させていただいた場合、プラスミドDNAの受け入れやQCチェックにかかる日数は作業日数に含まれていません。
納品物
パイロット、中容量、大容量のAAVパッケージングをご注文の場合：
- カスタムAAV（10本のマイクロチューブに分注）
- 無料のコントロールウイルス* （１または2本のマイクロチューブに分注）仕様は表3をご覧ください。
- カルタヘナ法26条1項情報公開書類(メール添付)
- ウイルス品質検査証明書COA
超純粋パイロット、中容量、大容量のAAVパッケージングをご注文の場合：
- カスタムAAV（10本のマイクロチューブに分注）
- ”追加” 注文(オプション)で場合、超純粋コントロールウイルスを低価格でご購入いただけます。(カスタムウイルスと同量。４または10本のマイクロチューブに分注)* 仕様は表3をご覧ください。
- カルタヘナ法26条1項情報公開書類(メール添付)
- ウイルス品質検査証明書COA
* コントロールウイルスとは：カスタムウイルスと同一実験系のウイルスベクターをパッケージングしたウイルスです。ウイルスの感染効率の最適化などの目的に使用していただける標準コントロールです。ご依頼いただいたカスタムベクターの空ベクターコントロールではありません。ご了承ください。例えば、カスタムウイルスが目的遺伝子の強制発現系であれば、コントロールはEGFPを強制発現するウイルスです。カスタムウイルスがshRNAの発現系では、コントロールはscramble shRNAを発現するウイルスです。
表３：コントロールウイルス仕様
| ベクターシステム | コントロールベクター | コントロールベクター ID | カスタムウイルスのサイズ | コントロールウイルスの仕様 | 価格 (税抜き) |
|
AAV 遺伝子発現システム |
pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE | VB190926-1395dab | パイロット | >2.0x1011 GC/ml, 100 ul in PBS | 無料 |
| 中容量 | >2.0x1011 GC/ml, 2x100 ul in PBS | 無料 | |||
| 大容量 | >1013 GC/ml, 2x100 ul in PBS | 無料 | |||
| 超純粋パイロット | >1013 GC/ml, 4x25 ul in PBS | 51,000円 | |||
| 超純粋中容量 | >1013 GC/ml, 10x50 ul in PBS | 71,500円 | |||
| 超純粋大容量 | >1013 GC/ml, 10x100 ul in PBS | 110,500円 | |||
|
AAV U6プロモーターshRNA ノックダウンシステム |
pAAV[shRNA]-EGFP-U6> Scramble_shRNA |
VB180117-1020znr | パイロット | >2.0x1011 GC/ml, 100 ul in PBS | 無料 |
| 中容量 | >2.0x1011 GC/ml, 2x100 ul in PBS | 無料 | |||
| 大容量 | >1013 GC/ml, 2x100 ul in PBS | 無料 | |||
| 超純粋パイロット | >1013 GC/ml, 4x25 ul in PBS | 61,000円 | |||
| 超純粋中容量 | >1013 GC/ml, 10x50 ul in PBS | 87,000円 | |||
| 超純粋大容量 | >1013 GC/ml, 10x100 ul in PBS | 110,500円 | |||
| AAV miR30型 shRNAノックダウンシステム | pAAV[miR30]-CMV>EGFP:Scramble_miR30-shRNA:WPRE | VB190813-1134mnj | パイロット | >2.0x1011 GC/ml, 100 ul in PBS | 無料 |
| 中容量 | >2.0x1011 GC/ml, 2x100 ul in PBS | 無料 | |||
| 大容量 | >1013 GC/ml, 2x100 ul in PBS | 無料 | |||
| 超純粋パイロット | >1013 GC/ml, 4x25 ul in PBS | 51,000円 | |||
| 超純粋中容量 | >1013 GC/ml, 10x50 ul in PBS | 71,500円 | |||
| 超純粋大容量 | >1013 GC/ml, 10x100 ul in PBS | 110,500円 | |||
| AAV CRISPR system | pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE | VB190926-1395dab | パイロット | >2.0x1011 GC/ml, 100 ul in PBS | 無料 |
| 中容量 | >2.0x1011 GC/ml, 2x100 ul in PBS | 無料 | |||
| 大容量 | >1013 GC/ml, 2x100 ul in PBS | 無料 | |||
| 超純粋パイロット | >1013 GC/ml, 4x25 ul in PBS | 51,000円 | |||
| 超純粋中容量 | >1013 GC/ml, 10x50 ul in PBS | 71,500円 | |||
| 超純粋大容量 | >1013 GC/ml, 10x100 ul in PBS | 110,500円 |
ウイルス粒子作成、精製、タイター測定
組み換えAAVは産生細胞（HEK293T)に以下の３種のプラスミドを一過的トランスフェクションして生産します。
- Transferプラスミド (または cis-plasmid) : プロモーター、gene of interest（GOI）をクローニングしたトランスファーベクター。AAV2由来のITRシークエンスを使用。VectorBuilderではカスタムベクターデザインとベクター構築も費用別で受託しています。
- pRep-Capプラスミド：弊社独自デザイン。ご希望の組織指向性を持つセロタイプ18種類から選択。
- pHelper プラスミド：弊社独自デザイン。アデノウイルスE4, E2A, VA遺伝子をコード
in vitro用のウイルスは、ウイルス粒子を細胞溶解液から回収し、PEG沈殿で濃縮します。 in vivo用の超純粋グレードウイルスは、さらに塩化セシウム密度勾配超遠心分離によって空ベクターの除去と精製を行います。カスタムサービスでは、ご希望のカラムによる精製も追加対応いたします。お見積りなどは別途お問合せください。
タイターはAAV2ITRシークエンスに対するプライマーを用いてqPCRによって決定します。
品質
VectorBuilderで受託製造されたカスタムAAVは、以下の品質検査を行い品質検査証明書を発行します。
- タイター値: qPCRから得られたタイター値。VectorBuilderで受託構築したレンチウイルスベクターを使ったウイルスパッケージングをご注文の場合は、ウイルスタイター保証があります。
- バイオバーデンテスト結果：バクテリアや菌類の滅菌性データ
- マイコプラズマテスト結果
- 発現テスト：トランスファーベクターに蛍光タンパク質がクローニングされている場合は、HEK293T細胞にウイルスを感染させ、感染細胞が蛍光を発現していることを確認します。
他の品質検査データ（例：ウイルス純度、エンドトキシン値など）が必要な場合は、別途お見積りをさせていただきます。詳細はメールにてお問い合わせください。service-jp@vectorbuilder.com
ユーザーご提供のトランスファーベクターからのウイルス粒子作成について
ユーザーお手持ちのウイルスベクターからウイルス粒子の受託作製も受注しています。ウイルスベクターは マテリアルサブミッションガイドラインに沿って弊社にお送りください。お受け取りしたプラスミドベクターは、QCチェックとして、マキシプレップ、プラスミドの制限酵素サイトの確認と、サンガーシークエンシングでのシークエンスの確認を行います。一律13,000円のQCチェック費用をお見積りに加算させていただいています。 QCチェックに合格後、ご注文のウイルスパッケージングサービスを行います。ウイルスパッケージングのお見積りの作業日数には QCチェックにかかる日数（通常5営業日）は含まれていません。あらかじめご了承ください。
ご質問
よくあるご質問は Vector FAQ からご覧になれます。弊社からご提供させていただいている受託サービスについて、もっと詳細な情報が必要な場合は、ベクタービルダー・ジャパンのサービスサポートまでお問合せください。
マイベクターをデザインする
オンラインポータルを使って、自分でベクターデザインを行い、そのベクターの見積もりを依頼する場合。
デザインリクエストを送る
ベクタービルダーにベクターデザインと見積もりの両方を依頼する場合。その他のカスタム受託サービスのお見積りもここからお問い合わせください。