アデノ随伴ウイルス（AAV）作製サービス

AAV作製と品質検査

組み換えAAVの製造では、目的の遺伝子（GOI）をクローニングしたトランスファープラスミドを、Rep-capプラスミドおよびアデノウイルス遺伝子（E4、E2A、VA）をコードするヘルパープラスミドとともに、HEK293Tウイルス産生細胞にコトランスフェクトします。短いインキュベーション後、セロタイプ（血清型）に応じて細胞溶解物または上清からウイルス粒子を回収し、PEG沈殿によって濃縮します。超純粋AAV（in vivoグレード）の場合、ウイルス粒子は塩化セシウム（CsCl）密度勾配超遠心分離によってさらに空ベクターの除去と精製および濃縮されます。ウイルスタイターはAAV2ITRシークエンスに対するプライマーを用いてqPCRによってウイルスゲノムコピー数を計測します。

図 1. トリプルトランスフェクションによるAAVパッケージングのワークフロー

VectorBuilderが受託作製した AAVは次の品質検査を行い品質検査証明書を発行します：タイター測定、細菌および真菌の無菌試験、マイコプラズマ検出試験。またトランスファーベクターに蛍光レポーター遺伝子がクローニングされている場合は、HEK293T細胞に受託作製したウイルスを感染させ、感染細胞が蛍光を発現していることを確認します。蛍光レポーター遺伝子がクローニングされていない場合は、薬剤耐性によって感染細胞の生存を確認します。超純粋AAVの場合、SDS-PAGE分析によるAAVキャプシッド（VP1,VP2, VP3）の精製度とウイルス溶液中のエンドトキシンのアッセイを行います。

AAV製造と品質検査 

Our baculovirus-based AAV packaging workflow consists of two main steps as shown in 図 1 below. Step 1 involves the generation of two recombinant baculoviruses, specifically the first one expressing the gene of interest (GOI) flanked by the AAV inverted terminal repeats (ITRs) and a second helper baculovirus expressing the AAV rep and cap genes. In step 2 recombinant AAV particles are generated by co-infecting insect cells with the two recombinant baculoviruses produced in step 1.

For generating the two recombinant baculoviruses (one expressing the GOI flanked by AAV ITRs and the other expressing the AAV rep/cap genes), the expression cassette for each baculovirus is first cloned into a baculovirus transfer vector. The baculovirus transfer plasmid is then co-transformed with a helper plasmid expressing the Tn7 transposase into the bacterial host harboring the empty baculovirus shuttle vector (a.k.a. bacmid) to generate recombinant bacmid. The recombinant bacmid is then transfected into insect Sf9 cells. After a short incubation period, viral particles are harvested from medium and further concentrated by sucrose cushion centrifugation. We use a qPCR-based approach to measure baculovirus titer. Both recombinant baculoviruses are then co-infected into insect cells. After an incubation period of 72-96 hours, AAV particles are harvested from the cell lysate as well as the supernatant and concentrated by PEG precipitation. For ultra-purified AAV (in vivo grade), viral particles are further purified and concentrated by cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation. We use a qPCR-based approach to measure AAV titer.

図 1. Tバキュロウイルスを使用したAAVの大量製造ワークフロー

For each AAV produced by VectorBuilder, quality control includes titer measurement, sterility testing for bacteria and fungi, and mycoplasma detection. If the transfer vector encodes a fluorescent protein, we would perform transduction test to detect corresponding fluorescence. Additionally, for ultra-purified AAV, we routinely sample virus quality by SDS-PAGE analysis and endotoxin assay.

実験による検証 

We have developed a number of proprietary techniques to optimize our baculovirus-based AAV packaging protocol and our virus has been validated to exhibit high transduction efficiency in mammalian cells.

図 2. 293T細胞に EGFPを発現するバキュロウイルス-AAV1 と AAV2 を MOI 10000で遺伝子導入した。 倍率: 100x. 左: 明視野細胞像。右:蛍光顕微鏡下によるGFPの緑色蛍光を発現する細胞像。

AAVセロタイプ（血清型）リスト

* 目的遺伝子を搭載するベクターのITRはAAV2ゲノム由来のシークエンスを使用しています。この表で示しているセロタイプ（血清型）とは、ウイルスキャプシッドタンパク質を指します。他セロタイプのITRを使ったは要相談ください（タイター非保障）。