アデノ随伴ウイルス（AAV)粒子作製

アデノ随伴ウイルス（Adeno-associated virus ：AAV) は、in vitroとin vivoの両系で遺伝子導入に使えるため、広範なアプリケーションに一般的に使用されているウイルスベクターです。 AAVは、多彩な種類の哺乳類動物由来細胞に遺伝子導入が行え、宿主生物内で病原性が低いことから、遺伝子治療用として最も有効な手段であると期待されています。VectorBuilderは独自の技術と試料をもちい、ウイルスのタイター、純度、生存率、均一性に優れたAAVパケ―ジングプロトコールを開発しました。その結果、多くのユーザーに満足していただき、AAVベクタークローニングとウイルスパッケージングの両方をリピートしてご注文をいただいています。

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AAVパッケージングのご注文方法

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VectorBuilderが提供するAAVの種類

第二世代のAAVパッケージングを次のセロタイプに対してご用意しています* 。

ssAAV (single-stranded AAV) と scAAV (self-complementary AAV)の両方でご対応しています。

セロタイプ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6.2, 7, 8, 9, rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro and AAV2-QuadYF.

* ご注意ください：ご希望の遺伝子をクローニングするトランスファーベクターの５’と３’の ITRシークエンスは AAV2 のITR由来のシークエンスを使っています。弊社でいうセロタイプの違いは、キャプシッドタンパク質のタイプを指しています。

セロタイプの違いによるキャプシッドタンパク質VP1 のアミノ酸シークエンスのご確認はこちらをご覧ください >>

価格と作業日数

VectorBuilderのAAVパッケージングサービスは、独自の技術改良によって、同業種間でも最も高品質で、他メーカーに比べて早い作業日数とリーズナブルな価格でご提供させていただいています。価格と作業日数を下の表に、AAVパッケージングのサイズと推奨使用系毎に表示します:

サイズ	推奨の使用系	タイターと容量*	価格(税抜き)	作業日数**
パイロット	培養細胞	>10¹¹ GC/ml, 10x 25 ul, PBS buffer	64,000円	15-25 日
中容量	培養細胞	>10¹¹ GC/ml, 10x 100 ul, PBS buffer	89,000円	15-25 日
大容量	培養細胞	>10¹² GC/ml, 10x 100 ul, PBS buffer	139,000円	15-25 日
超純粋パイロット	培養細胞とin vivo	>10¹³ GC/ml, 4x 25 ul, PBS buffer	151,500円	15-25 日
超純粋中容量	培養細胞と in vivo	>10¹³ GC/ml, 10x 50 ul, PBS buffer	226,500円	15-25 日

* ベクタービルダーのウイルスタイター保証は、ウイルスにパッケージングされる5’ ITR から3’ ITRの領域の長さが、AAVの場合、4.7 kb 以下の場合に適用されます。搭載上限を超えている場合、領域欠損などが起こり、ウイルス粒子は機能欠失を生じている場合があります。

タイター保証を適用させていただけないケースは以下のような場合もあります。ご了承ください。

ベクターにクローニングされているシークエンスがパッケージングプロセスに悪影響を及ぼすと考えられるもの。例えば、細胞毒性を持つproapoptotic遺伝子群、細胞凝集を誘引する膜タンパク質シークエンス、パッケージング細胞またはウイルスの生合成に負の影響を生じる遺伝子、反復シークエンスや高GCリッチシークエンスなど、ベクタークローニングの際にリアレンジメントや二次構造を生じる可能性の高いシークエンスを含むベクターの場合
ユーザーからご提供されたウイルスベクターを使ってのウイルスパッケージングのご注文の場合。弊社のウイルスパッケージングプロトコールは、弊社のベクター構築用のコンポーネントやベクターバックボーンに対して最適化を行っているため。

** Turnaround time is defined as the time from when an order is accepted to when it is shipped. It does not include waiting time for any materials that the customer needs to supply (e.g. viral vectors).

Deliverables

If you choose pilot, medium or large scale AAV packaging, each order includes the following deliverables:

Aliquots of custom AAV at selected scale
Free: aliquots of control virus*

If you choose ultra-purified pilot or ultra-purified medium scale AAV packaging (in vivo grade), each order includes the following deliverables:

Aliquots of custom AAV at selected scale
"Add-on"purchase (optional): aliquots of ultra-purified control virus*

* The control virus is designed to match the biological application of the custom virus and to be used for testing transduction. For example, if the custom virus overexpresses a gene, then the control virus provided will overexpress EGFP, and if the custom virus expresses an shRNA against a gene, then the control virus provided will express a scramble shRNA. Detailed information of the control virus is shown below:

Vector System	Control Vector Name	Control Vector ID	Custom Virus Packaging Scale	Corresponding Control Virus Amount	Price (USD)
AAV gene expression system	pAAV[Exp]-CMV>EGFP	VB150925-10026	Pilot	>10¹¹ GC/ml, 100 ul in PBS	Free
			Medium	>10¹¹ GC/ml, 2x 100 ul in PBS	Free
			Large	>10¹¹ GC/ml, 2x 100 ul in PBS	Free
			Ultra-purified pilot	>10¹³ GC/ml, 4x 25 ul in PBS	TBD
			Ultra-purified medium	>10¹³ GC/ml, 10x 50 ul in PBS	TBD
AAV U6-based shRNA knockdown system	pAAV[shRNA]-EGFP-U6> Scramble_shRNA	VB180117-1020znr	Pilot	>10¹¹ GC/ml, 100 ul in PBS	Free
			Medium	>10¹¹ GC/ml, 2x 100 ul in PBS	Free
			Large	>10¹¹ GC/ml, 2x 100 ul in PBS	Free
			Ultra-purified pilot	>10¹³ GC/ml, 4x 25 ul in PBS	TBD0
			Ultra-purified medium	>10¹³ GC/ml, 10x 50 ul in PBS	TBD
AAV miR30-based shRNA knockdown system	pAAV[miR30]-CMV>EGFP:Scramble_miR30-shRNA	VB180124-1104yzn	Pilot	>10¹¹ GC/ml, 100 ul in PBS	Free
			Medium	>10¹¹ GC/ml, 2x 100 ul in PBS	Free
			Large	>10¹¹ GC/ml, 2x 100 ul in PBS	Free
			Ultra-purified pilot	>10¹³ GC/ml, 4x 25 ul in PBS	TBD
			Ultra-purified medium	>10¹³ GC/ml, 10x 50 ul in PBS	TBD
AAV CRISPR system	pAAV[Exp]-CMV>EGFP	VB150925-10026	Pilot	>10¹¹ GC/ml, 100 ul in PBS	Free
			Medium	>10¹¹ GC/ml, 2x 100 ul in PBS	Free
			Large	>10¹¹ GC/ml, 2x 100 ul in PBS	Free
			Ultra-purified pilot	>10¹³ GC/ml, 4x 25 ul in PBS	TBD
			Ultra-purified medium	>10¹³ GC/ml, 10x 50 ul in PBS	TBD

ウイルス粒子作成、精製、タイター測定

AAVパッケージングは解析対象遺伝子（gene of interest :GOI)をもったトランスファーベクターを、弊社独自デザインのRep-capプラスミドとＡＡＶ複製を担うE4, E2A, VAをコードするヘルパープラスミドとともに、パッケージング細胞にコトランスフェクトします。短期間のインキュベーション後、細胞の上澄みよりウイルス粒子を回収し、 PEG沈殿で濃縮します。 in vivo純度の超純粋グレードの精製は、塩化セシウム密度勾配超遠心分離をかけます。AAVタイターは qPCRに基づいた手法でお測定しています。

タイター測定方法についてもっと読む>>

品質管理

VectorBuilderで受託製造されたAAVには、タイター測定値、バクテリアや菌類の滅菌性の検査、マイコプラズマのコンタミ検査の品質テスト結果をお付けしています。

VectorBuilderに受託構築依頼されたウイルスベクターからウイルス粒子を作成する場合は、タイター保障をお付けしています。また、ベクターに蛍光タンパク質のコーディングが入っている場合は、HEC293細胞にウイルスを感染させ、細胞が蛍光を発現していることも確認します。さらに、超純粋レンチウイルスパッケージングの場合は、エンドトキシンアッセイの検査結果とSDS-PAGEの結果もお付けしています。

企業ユーザーにはさらに詳細な検査データを発行いたしますが有料となっています。詳しくはお問い合わせください。service-jp@vectorbuilder.com

ユーザーご提供のトランスファーベクターからのウイルス粒子作成について

ユーザーがお持ちのレンチウイルスベクターからウイルス粒子の作成もいたします。レンチウイルスベクターはマテリアルサブミッションガイドラインに沿って弊社にお送りください。マテリアルの未達によるプロジェクトの遅延やマテリアルのダメージを予防するために、ガイドラインに従ってマテリアルのご発送を行ってください。ユーザーからご送付いただいたマテリアルは、弊社でQCチェックとして、プラスミドをマキシプレップし、プラスミドの制限酵素サイトの確認と、サンガーシークエンシングでのシークエンスの確認を行うため、一律12500円のQCチェック費用を、お見積りに加算させていただいています。 QCチェックにパスしてからご注文の受託サービスに入りますので、お見積りの作業日数には QCチェックにかかる日数はふくまれていないことをあらかじめご了承ください。

ご質問

よくあるご質問は Vector FAQ からご覧になれます。弊社からご提供させていただいている受託サービスについて、もっと詳細な情報が必要な場合は、ベクタービルダー・ジャパンのサービスサポートまでお問合せください。