アデノ随伴ウイルス(AAV)作製サービス

組み換えアデノ随伴ウイルス(Adeno associated virus, AAV)は、in vitroおよびin vivoの両系で遺伝子導入に用いることができるため、最も用途が豊富で広範なアプリケーションに使用されているウイルスベクターです。AAVは、多種多様な哺乳動物細胞に形質導入できる特性と、ヒトへの非病原性および低免疫原性から、最も有効な遺伝子治療用ウイルスベクターとして期待されています。

VectorBuilderのAAVパッケージングサービスは、ウイルスタイター、純度、ウイルス生存率、および均質性に優れた組換えAAVを製造するプロトコールを大幅に改良し、独自の技術と試薬を開発しました。その結果、AAVプラスミドベクター構築とAAVウイルスパッケージングの両方をご注文いただくリピーターユーザーが多く、ユーザーの満足度が高いことが特徴です。さらに2020年より、このページでご紹介しているリサーチグレードAAVウイルス作製サービスに加えて、臨床応用に向けた GMPグレードのAAV製造サービス もご提供しています。そのため、基礎生命科学研究、創薬研究そして臨床研究へと、一貫したサービスをお届けできる強みも備えています。

ご提供しているアデノ随伴ウイルスの種類
  • 1本鎖AAV (single-strand AAV, ssAAV) と 自己相補型AAV (self-complementary AAV, scAAV)
  • 18種の血清型(セロタイプ): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6.2, 7, 8, 9, rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF and AAV2.7m8

サービスの詳細

トリプルトランスフェクション作製
バキュロウイルス型作製
価格と作成作業日数
スケール 推奨使用系 一般的なタイター 最小タイター 容量 価格(税別・送料別) 作業日数
パイロット 培養細胞 >1012 GC/ml >2x1011 GC/ml 250 ul (10x25 ul) 52,000円 10-18 日
中容量 1ml (10x100 ul) 78,000円
大容量 >5x1012 GC/ml >2x1012 GC/ml 1ml (10x100 ul) 130,000円
超純粋パイロット 培養細胞&in vivo >2x1013 GC/ml >1013 GC/ml 100 ul (4x25 ul) 156,000円 16-26 日
超純粋中容量 500 ul (10x50 ul) 234,000円
超純粋大容量 1 ml (10x100 ul) 364,000円

GC=ゲノムコピー

トリプルトランスフェクションで作製できるセロタイプ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6.2, 7, 8, 9, rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF そしてAAV2.7m8。

セロタイプ4,6,DJ/8は、保証タイターが30-50%になります。あらかじめご了承ください。

納品形態
培養細胞用AAVウイルス 超純粋AAVウイルス
カスタムAAVウイルス カスタムAAVウイルス

無料: 標準コントロールウイルス

  • パイロット: >2x1011 GC/ml, 100 ul
  • 中容量: >2x1011 GC/ml, 2x100 ul
  • 大容量: >2x1011 GC/ml, 2x100 ul

  追加購入(オプション): 超純粋標準コントロールウイルス

  • 超純粋パイロット: >1013 GC/ml, 4x25 ul, 52,000円(税抜き)
  • 超純粋中容量: >1013 GC/ml, 10x50 ul, 78,000円(税抜き)
  • 超純粋大容量: >1013 GC/ml, 10x100 ul, 122,500円(税抜き)

メール添付:カルタヘナ法26条1項情報公開書類、品質検査証明書(COA)

メール添付:カルタヘナ法26条1項情報公開書類、品質検査証明書(COA)

既製標準コントロールウイルス

既製標準コントロールウイルスとは:カスタムウイルスをご購入いただく場合、 弊社既製品のコントロールウイルスを無料(パイロット、中容量、大容量用)または割引特価(超純粋パイロット、超純粋中容量、超純粋大容量用)でご提供しています。既製標準コントロールウイルスは、感染効率の最適化などの目的に使用していただけるコントロールウイルスです。ご依頼いただいたカスタムベクターのカスタム空ベクターコントロールやカスタムコントロールではありません。厳密な実験用コントロールウイルスではないことをご了承ください(カスタムコントロールは別途デザインとお見積りをいたします。お問合せください。)。例えば、カスタムウイルスが目的遺伝子の強制発現系であれば、コントロールはEGFPを強制発現するウイルスです。カスタムウイルスがshRNAの発現系では、コントロールはscramble shRNAを発現するウイルスです:

ベクターシステム 既製標準コントロールベクター名  Vector ID
AAV遺伝子発現システム pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE VB190926-1395dab
AAV U6ベース shRNA ノックダウンシステム pAAV[shRNA]-EGFP-U6>Scramble_shRNA VB180117-1020znr
AAV miR30ベース shRNAノックダウンシステム pAAV[miR30]-CMV>EGFP:Scramble_miR30-shRNA:WPRE VB190813-1134mnj
AAV CRISPRシステム pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE VB190926-1395dab
サイズ
推奨使用系 最小タイター
容量 価格(税別・送料別) 作業日数
超純粋パイロット 培養細胞&in vivo >5x1013 GC/ml 1 ml (10x100 ul) 728,000円 42-56 日
超純粋中容量 5 ml (25x200 ul) 2,626,000円 49-63 日
超純粋大容量 10 ml (50x200 ul) 4,966,000円 56-70 日

注:

1. GC = ゲノムコピー

2. バキュロウイルス製造AAVでは次のセロタイプが使えます: AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9.

納品形態
カスタムAAV

  追加購入(オプション): 超純粋標準コントロールウイルス

  • 超純粋パイロット: >1013 GC/ml, 10x100 ul, 243,500円(税抜き)
  • 超純粋中容量: >1013 GC/ml, 25x200 ul, 876,500円(税抜き)
  • 超純粋大容量: >1013 GC/ml, 50x200 ul, 1,656,500円(税抜き)
コントロールウイルス

既製標準コントロールウイルスは、感染効率の最適化などの目的に使用していただけるコントロールウイルスです。ご依頼いただいたカスタムベクターのカスタム空ベクターコントロールやカスタムコントロールではありません。厳密な実験用コントロールウイルスではないことをご了承ください(カスタムコントロールは別途デザインとお見積りをいたします。お問合せください。)。例えば、カスタムウイルスが目的遺伝子の強制発現系であれば、コントロールはEGFPを強制発現するウイルスです:

ベクターシステム コントロールベクター名 コントロールベクター ID
キメラバキュロウイルス-AAV 遺伝子発現ベクター pBV/AAV[Exp]-CMV>EGFP VB200825-1105uwz
保存方法

AAVはPBSバッファーの溶液でチューブに分注し、凍結したものをドライアイス梱包で出荷・納品します。お受け取り後は、-80°Cで長期間(1年間)は安定です。-20°Cでは短期間(2〜3週間)の安定した保存が可能です。一旦解凍したAAVウイルスは4°Cで1〜2週間安定して保存できます。 AAVは他の多くのウイルス(レンチウイルスなど)に比べて温度変化に対して寛容なため、ウイルス活性の損失を最小限に抑えて数回凍結解凍が可能です。しかし、実際には凍結融解サイクルの繰り返しはなるべく避けて、融解後の分注チューブは4度で保存し、1〜2週間で使いきってください。

技術的情報

トリプルトランスフェクションで作製
バキュロウイルスで作製
AAV作製と品質検査

組み換えAAVの製造では、目的の遺伝子(GOI)をクローニングしたトランスファープラスミドを、Rep-capプラスミドおよびアデノウイルス遺伝子(E4、E2A、VA)をコードするヘルパープラスミドとともに、HEK293Tウイルス産生細胞にコトランスフェクトします。短いインキュベーション後、セロタイプ(血清型)に応じて細胞溶解物または上清からウイルス粒子を回収し、PEG沈殿によって濃縮します。超純粋AAV(in vivoグレード)の場合、ウイルス粒子は塩化セシウム(CsCl)密度勾配超遠心分離によってさらに空ベクターの除去と精製および濃縮されます。ウイルスタイターはAAV2ITRシークエンスに対するプライマーを用いてqPCRによってウイルスゲノムコピー数を計測します。

図 1. トリプルトランスフェクションによるAAVパッケージングのワークフロー

VectorBuilderが受託作製した AAVは次の品質検査を行い品質検査証明書を発行します:タイター測定、細菌および真菌の無菌試験、マイコプラズマ検出試験。またトランスファーベクターに蛍光レポーター遺伝子がクローニングされている場合は、HEK293T細胞に受託作製したウイルスを感染させ、感染細胞が蛍光を発現していることを確認します。蛍光レポーター遺伝子がクローニングされていない場合は、薬剤耐性によって感染細胞の生存を確認します。超純粋AAVの場合、SDS-PAGE分析によるAAVキャプシッド(VP1,VP2, VP3)の精製度とウイルス溶液中のエンドトキシンのアッセイを行います。

AAV製造と品質検査 

Our baculovirus-based AAV packaging workflow consists of two main steps as shown in 図 1 below. Step 1 involves the generation of two recombinant baculoviruses, specifically the first one expressing the gene of interest (GOI) flanked by the AAV inverted terminal repeats (ITRs) and a second helper baculovirus expressing the AAV rep and cap genes. In step 2 recombinant AAV particles are generated by co-infecting insect cells with the two recombinant baculoviruses produced in step 1.

For generating the two recombinant baculoviruses (one expressing the GOI flanked by AAV ITRs and the other expressing the AAV rep/cap genes), the expression cassette for each baculovirus is first cloned into a baculovirus transfer vector. The baculovirus transfer plasmid is then co-transformed with a helper plasmid expressing the Tn7 transposase into the bacterial host harboring the empty baculovirus shuttle vector (a.k.a. bacmid) to generate recombinant bacmid. The recombinant bacmid is then transfected into insect Sf9 cells. After a short incubation period, viral particles are harvested from medium and further concentrated by sucrose cushion centrifugation. We use a qPCR-based approach to measure baculovirus titer. Both recombinant baculoviruses are then co-infected into insect cells. After an incubation period of 72-96 hours, AAV particles are harvested from the cell lysate as well as the supernatant and concentrated by PEG precipitation. For ultra-purified AAV (in vivo grade), viral particles are further purified and concentrated by cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation. We use a qPCR-based approach to measure AAV titer.

図 1. Tバキュロウイルスを使用したAAVの大量製造ワークフロー

For each AAV produced by VectorBuilder, quality control includes titer measurement, sterility testing for bacteria and fungi, and mycoplasma detection. If the transfer vector encodes a fluorescent protein, we would perform transduction test to detect corresponding fluorescence. Additionally, for ultra-purified AAV, we routinely sample virus quality by SDS-PAGE analysis and endotoxin assay.

実験による検証 

We have developed a number of proprietary techniques to optimize our baculovirus-based AAV packaging protocol and our virus has been validated to exhibit high transduction efficiency in mammalian cells.

図 2. 293T細胞に EGFPを発現するバキュロウイルス-AAV1 と AAV2 を MOI 10000で遺伝子導入した。 倍率: 100x. 左: 明視野細胞像。右:蛍光顕微鏡下によるGFPの緑色蛍光を発現する細胞像。

AAVセロタイプ(血清型)リスト
セロタイプ別
組織別
セロタイプ 組織指向性
AAV1 Smooth muscle, skeletal muscle, CNS, brain, lung, retina, inner ear, pancreas, heart, liver
AAV2 Smooth muscle, CNS, brain, liver, pancreas, kidney, retina, inner ear, testes
AAV3 Smooth muscle, liver, lung
AAV4 CNS, retina, lung, kidney, heart
AAV5 Smooth muscle, CNS, brain, lung, retina, heart
AAV6 Smooth muscle, heart, lung, pancreas, adipose, liver
AAV6.2 Lung, liver, inner ear
AAV7 Smooth muscle, retina, CNS, brain, liver
AAV8 Smooth muscle, CNS, brain, retina, inner ear, liver, pancreas, heart, kidney, adipose
AAV9 Smooth muscle, skeletal muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, inner ear, testes, kidney, adipose
AAVrh10 Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney
AAV-DJ Liver, heart, kidney, spleen
AAV-DJ/8 Liver, brain, spleen, kidney
AAV-PHP.eB CNS
AAV-PHP.S PNS
AAV2-retro Spinal nerves
AAV2-QuadYF Endothelial cell, retina
AAV2.7m8 Retina, inner ear
組織 推薦する AAV セロタイプ
Smooth muscle AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10
Skeletal muscle AAV1, AAV9
CNS AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-PHP.eB
PNS AAV-PHP.S
Brain AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8
Retina AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8
Inner ear AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8
Lung AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAVrh10
Liver AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
Pancreas AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10
Heart AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ
Kidney AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
Adipose AAV6, AAV8, AAV9
Testes AAV2, AAV9
Spleen AAV-DJ, AAV-DJ/8
Spinal nerves AAV2-retro
Endothelial cells AAV2-QuadYF

* 目的遺伝子を搭載するベクターのITRはAAV2ゲノム由来のシークエンスを使用しています。この表で示しているセロタイプ(血清型)とは、ウイルスキャプシッドタンパク質を指します。他セロタイプのITRを使ったは要相談ください(タイター非保障)。

メジャーなウイルスキャプシッドタンパク質(VP1)のアミノ酸シークエンスはここから確認できます。>>
関連技術情報
ユーザーインストラクション 化学物質等安全データシート  (MSDS) 品質検査証明書 (Certificate of Analysis, COA)

ご注文方法

プラスミドベクター構築とウイルスパッケージングを同時注文する場合
ウイルスパッケージングのみ注文する場合(ユーザー提供プラスミド、または弊社にストックしたベクター)

ユーザー提供のプラスミドDNAベクターからのウイルスパッケージング

ユーザー提供のAAVウイルスプラスミドをパッケージに使用する場合は マテリアルサブミッションガイドライン に従ってマテリアルを準備し、ベクタービルダー・ジャパン株式会社に発送してください。ユーザーからご提供されるマテリアルはVectorBuilderでお受け取り後、品質検査(QCチェック)に合格することを必須条件としています。QCチェックは、マテリアルごとに14,000円からの追加料金が発生する場合があります。さらにQCチェックに合格するまで、ご依頼の受託サービスが開始することができません。そのため、正しくマテリアルを準備、発送し、プロジェクトが遅延しないよう心がけてください。またユーザーご提供のプラスミドDNAを使ったウイルスパッケージングでは、高タイターを得るには不確定要素が多く、タイター保証に限界があります。そのためタイター保証は不適用とさせていただいています。

Q&A

他のウイルスベクターに対するAAV ウイルスの特徴は?
レンチウイルス MMLV アデノウイルス AAV
組織指向性 広範 広範 数細胞種には不適 ウイルスセロタイプに依る
非分裂細胞への感染 感染する 感染しない 感染する 感染する
安定発現または一過性発現 ゲノムへの挿入による安定発現 ゲノムへの挿入による安定発現 一過的、エピソーマル 一過的、エピソーマル 
得られる最高タイター 高い 中程度 非常に高い 高井
プロモーターのカスタマイズ 不可
主な使用系 培養細胞、 in vivo 培養細胞、 in vivo In vivo In vivo
In vivoでの抗原性 低い 低い 高い 非常に低い
VectorBuilderではウイルスタイターをどのように求めていますか?

標準的なウイルスタイター測定法は、ウイルス粒子からウイルスゲノムを直接抽出し、ITR領域を増幅するqPCRによって、ウイルスゲノムの物理的タイターを正確に定量化しています。オプションとして、他のタイター測定方法(ddPCR、TCID50など)もご提供しています。お見積りの際にお問合せください。

VectorBuilderのタイター保障の適用規則と不適用規則、そして作業日数について。

VectorBuilderで受託構築したプラスミドベクターからウイルスパッケージングを引き続き受注し、かつパッケージングされる5’ ITR から3’ ITRの領域の長さが4.7 kb 以下の場合、タイター保証をご提供しています。4.7 kb を超過した場合は、ウイルスパッケージングは可能ですが、ウイルスにパッケージされるDNAフラグメントが均一でななく、機能欠損したウイルスが生成されることが知られています。さらに以下の場合、タイター保証は適用外となっています:

  • セロタイプ4、セロタイプ6、セロタイプDJ/8のパッケージングの場合:他のセロタイプに比べて30-50%のタイターの保証となります。追加作製が必要な場合は改めてお見積りいたします。お問合せください。
  • ベクターに搭載されたORFがパッケージング過程に負の営業を及ぼす場合:例えば、細胞毒性を持つproapoptotic遺伝子群、細胞凝集を誘引する膜タンパク質シークエンス、パッケージング細胞またはウイルスの生合成に負の影響を生じる遺伝子、反復シークエンスや高GCリッチシークエンスなど、ベクタークローニングの際にリアレンジメントや二次構造を生じる可能性の高いシークエンスを含むベクターなどです。
  • ユーザーご提供のトランスファープラスミド(cis-plasmid)を使用したウイルスパッケージングのご依頼の場合:高タイターのウイルスパッケージングには不確定要素が多いため、タイター保証には限界があります。
  • ユーザーご提供のpRep-Capプラスミドや、pHelperプラスミドを使用したウイルスパッケージングのご依頼の場合:弊社のウイルスパッケージングプロトコールは、弊社のベクター構築用のコンポーネントやベクターバックボーンに対して最適化を行っているため、ユーザー提供のウイルスベクターからの高タイターパッケージングには不確定要素が多いため、保証には限界があります。あらかじめタイターをご指定いただいても保障の適用外となることもあります。

推定作業日数とは、ご注文いただいた受託サービスが弊社で受注され、作製終了し、品質検査に合格し、出荷準備に入るまでの期間を指しています。推定作業日数には、当社製造拠点から出荷ーユーザー納品までの日数は含まれていません。また、ユーザーご提供のプラスミドDNAの受け取り、QCチェックに合格するまでの日数は含まれていません。