piggyBac抗体軽鎖（Light chain）遺伝子発現ベクター

組換え抗体は診断薬や治療薬の分野で幅広く応用されています。現在、PD-L1、HER2、IL-17R、VEGFといった特定のタンパク質を標的とするモノクローナル抗体製品が、世界中で約180種類承認されています。遺伝子工学の発展により、理想的な腫瘍浸透作用、短い保持時間、免疫原性の低減を可能にし、これらの治療用抗体の生産を成功に導きました。これらの治療用組換え抗体は、主にin vitroの哺乳類細胞（例えばCHO細胞）で生産されます。この発現系における転写後修飾が、ヒトにおけるin vivoのプロセスに最も近いからです。

すべての抗体は可変領域（V）と定常領域（C）からなる重鎖と軽鎖から成り立っています。哺乳類では、重鎖C領域の配列によって、５つのアイソタイプ (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) に分けられます。哺乳類の抗体のアイソタイプは、軽鎖C領域によってコードされているラムダ（λ）型またはカッパー（κ）型の軽鎖を持っています。機能的な違いは今のところ明らかになっていないが、2種類の軽鎖の比率は種によって異なります。軽鎖は自己反応性を防ぐ役割を担っており、ホモ型相互作用を通じてレセプターの活性化を高めるという知見が増えつつあります。この定常領域に加え、重鎖および軽鎖のV領域も抗原認識に寄与しています。従って、軽鎖 V 領域をコードする配列をカスタマイズすることで、抗原結合特異性に関して、個別のニーズを満たすベクターを作製することができます。ベクター設計の際、軽鎖C領域は当社の軽鎖C領域データベース（ヒトκ、λ2軽鎖、マウスκ、λ1、λ2軽鎖を含む）から選択することもできますし、お客様独自の配列を入力することもできます。さらに、組換え抗体の分泌を増加させるために、シグナルペプチド（例： IL-2 sig）をベクターに追加することができます。

VectorBuilderのpiggyBac抗体軽鎖発現ベクターシステムは、哺乳動物細胞への抗体軽鎖発現カセットの非ウイルス性、トランスポゾンベースのデリバリーを実現する非常に効率的なツールです。このシステムには2つのベクターが含まれており、いずれも大腸菌プラスミドとしてデザインされています。第一のベクターはヘルパーPBaseプラスミドと呼ばれ、トランスポゼースをコードしています。第二のベクターはpiggyBacトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、転移される抗体軽鎖発現カセットを括る2つの末端反復（TR）を含んでいます。ヘルパーPBaseプラスミドとpiggyBacトランスポゾンプラスミドを標的細胞に共導入すると、ヘルパープラスミド由来のトランスポゼースがトランスポゾン上の2つのTRを認識し、フランキングされた抗体軽鎖発現カセットを宿主ゲノムに挿入します。挿入は通常、組み込まれた断片の両サイドに重複するTTAA配列を含む宿主染色体部位で起こります。PiggyBacはクラスIIトランスポゾンであり、カット＆コピー形式でコピーを残すことなくあちこちに転移します。(対照的に、クラスIトランスポゾンはコピー＆ペーストで転移します） ヘルパープラスミドは宿主細胞に一時的にトランスフェクトされるだけなので、時間の経過とともに失われます。ヘルパープラスミドが失われると、抗体軽鎖をコードする遺伝子が宿主細胞のゲノムに永久に留まることになります。

ベクターシステムの詳細については、下記の文献をご参照ください。

当社のpiggyBac抗体軽鎖発現ベクターは、ヘルパープラスミドと併用することにより、ユーザーが選択したプロモーターの下で、哺乳動物細胞において高レベルの恒常的抗体軽鎖発現を誘導するように設計されています。

技術的に簡単： トランスフェクション法によるプラスミドベクターの導入は、ウイルス生体へのパッケージングを必要とするウイルスベクターよりも、はるかに簡単な技術で行うことができます。

ベクターDNAの恒久的な組み込み： piggyBacトランスポゾンベクターを、トランスポゼースをコードするヘルパーベクターと共に細胞にトランスフェクトすることで、piggyBacベクターのITR間にデザインされた遺伝子は宿主細胞のゲノムに組み込まれます。そのため宿主細胞に長期的に抗体軽鎖を発現させることが可能です。

 再現性と大量生産： 組換えタンパク質は、トランスフェクトされた宿主細胞から直接採取されます。したがって、異なるバッチの再現性は容易に達成できます。さらに、宿主細胞の増幅により、大規模な抗体生産が可能になります。

細胞タイプの制限： piggyBacベクターの細胞への導入はトランスフェクションに依存しますが、トランスフェクション効率は細胞タイプによって大きく異なります。非分裂細胞は分裂細胞よりも、また初代培養細胞はライン化（株化）された細胞よりも導入が困難です。さらに、神経細胞や膵臓β細胞などある種の細胞では、トランスフェクション法でのベクター導入は難しいことが知られています。また、プラスミドのトランスフェクションはin vitro実験に限定され、in vivo実験は一般的ではありません。

重鎖と軽鎖の最適な発現比率の設定が難しい：A すべての抗体は重鎖と軽鎖から構成されています。抗体産生を成功させるには、重鎖と軽鎖の正確な発現比が必要です。これは、抗体重鎖を発現する第二の発現ベクターを共導入することによってのみ達成できます。重鎖と軽鎖の両方を最適に発現させることは、2つの異なるベクターで異なるプロモーターによって発現させるため、制御が難しい場合があります。

5’ ITR: 5’末端逆向き反復配列（5' inverted terminal repeat）。piggyBacトランスポゼースが両末端のITRを認識し、ITRとITR間にデザインされたDNA領域を宿主ゲノムに挿入します。

Promoter: 目的遺伝子を発現させるためのプロモーターをここに配置します。

Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核細胞において翻訳開始を促進させるため、目的遺伝子ORFの開始コドン直前に配置します。

IL2-sig: ヒトインターロイキン2のシグナルペプチド。タンパク質の分泌を促進します。

Light Chain Variable Region (VH): 抗原認識を司る軽鎖可変領域。

Light Chain Constant Region (CH): アイソタイプをコードする軽鎖定常領域。

rBG pA: ウサギ β-グロビンポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させます。

Marker: 薬剤耐性遺伝子 (例：ネオマイシン耐性遺伝子)、可視化遺伝子(例：EGFP)、またはデュアルレポーター遺伝子(例：EGFP/Neoの共発現)などのマーカー遺伝子。マーカーによってベクター内の遺伝子導入の有無を薬剤選択または可視化にて選抜できます。

3’ ITR: 3' 末端逆向き反復配列。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。