pUAST ショウジョウバエ遺伝子発現ベクター(プロモーター選択可)

概要

当社のpUASTベクターシステムはショウジョウバエP因子トランスポゾンを基にして開発されており、トランスジェニックハエの高効率な作製を実現します。プロモーターを選択することで目的遺伝子の遍在的もしくは組織特異的な発現、さらに発現の制御が可能になります。

pUASTベクターシステムはE.coliプラスミドとして設計された2つのベクターから構成されます。ひとつめは、転移されるDNA配列を挟み込むかたちで配置されたふたつのP因子末端反復配列(terminal repeat; TR)を含んでいるpUASTプラスミドです。もうひとつは、P因子トランスポゼースを持つヘルパープラスミドです。

pUASTとヘルパープラスミドが標的細胞に同時に注入されるとヘルパープラスミドからトランスポゼースが発現し、pUASTのふたつのP因子TRとその間のDNA配列を標的細胞のゲノムに挿入します。遺伝子配列の挿入される場所に明確なバイアスはありません。

P因子はクラスIIトランスポゾンであり、カット&ペースト様式(自身のコピーを残さない)で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー&ペースト様式をとります。転移がおこると、挿入サイトで8bpの反復配列が生じます。

トランスジェニックハエの作製は通常、ショウジョウバエの初期胚にpUASTとヘルパープラスミドを注入することで行われます。P因子トランスポゼースによってふたつのP因子TRで挟まれた配列の転移が生殖細胞でおこると、その子孫はトランスジェニックハエとなります。ヘルパープラスミドの消失までの短い間だけP因子トランスポゼースは発現し、宿主ゲノムへの恒久的なトランスポゾンの挿入を引き起こします。pUASTベクターのmini white遺伝子は目の色を決定し、遺伝子導入が成功したトランスジェニックハエの同定に使われます。PCRやその他の分子遺伝学的方法も同定に利用できます。

pUASTベクターシステムは当社のショウジョウバエプロモーターデータベースから実験目的に応じて任意の遺伝子発現用プロモーターを選択できます。当社のデータベースから次のようなプロモーターを選択できます。遍在的プロモーターとしてアクチン5C、ポリユビキチン、アルファ1チューブリン;組織特異的プロモーターとしてRh2(単眼特異的)、そして誘導型プロモーターとしてCu2+存在下で活性化するMtnプロモーターなどが選択できます。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Methods Mol Biol. 420:61 (2008) The use of P-element transposons to generate transgenic flies
Mol Cell Biol. 10:6172 (1990) Characterization of the actin 5C promoter
Mol Cell Biol. 8:4727 (1988) Characterization of the Drosophila polyubiquitin promoter
Nucleic Acids Res. 19:5037 (1991) Comparison of the alpha 1-tubulin promoter with other Drosophila promoters
Genetics. 120:173 (1988) Analysis of the Rh2 promoter
Genetics. 112:493 (1986) Characterization of the Mtn promoter

特徴

当社のpUASTショウジョウバエ遺伝子発現ベクターはP因子トランスポゼースによる効率的なゲノム挿入を実現します。当社のベクターはE.coliでの高コピー数複製とトランスジェニックハエの高効率な作製を可能にします。研究目的に応じて任意のプロモーター(遍在的、組織特異的、もしくは誘導型プロモーター)を選択できます。

メリット

高い柔軟性: 研究目的に応じて任意のプロモーター(遍在的、組織特異的、もしくは誘導型プロモーター)を選択して遺伝子を発現させることができます。

デメリット

ゲノムへのランダムな挿入: P因子の宿主ゲノムへのランダムな挿入は挿入場所の特定が難しく、挿入場所によっては導入された遺伝子の発現に影響を与えることがあります。宿主遺伝子や転写制御因子配列に遺伝子が挿入されると、それらの機能を破壊する可能性もあります

中程度の効率: P因子ベクターによる生殖細胞への遺伝子導入の効率はpUASTattBのようなφC31インテグラーゼを使用したシステムと比べると低くなります。

技術的な煩雑さ: トランスジェニックハエの作製は胚へのインジェクションやハエの飼育・交配など、高い技術が要求されます。

基本コンポーネント

P-element 3’ end: P因子の右TR(terminal repeat)もしくは3’TR。DNA配列が5'と3‘P因子TRで挟まれている場合、Pトランスポゼースは両TRに挟まれている領域を宿主ゲノムに挿入する。

Promoter: 下流の遺伝子の発現させるためのプロモーターが配置される。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 目的遺伝子のORFをここに配置する。

SV40 terminator: SV40(Simian virus 40)のポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写停止を助ける。

mini-white: ショウジョウバエのwhite遺伝子の派生型。ミニホワイト遺伝子は成体ショウジョウバエの目の色に関する優性マーカーであり、white遺伝子変異体をバックグラウンドとした遺伝子導入の成否の判断に使用する。

P-element 5’ end: P因子の左TR(terminal repeat)もしくは5’TR。DNA配列が5'と3‘P因子TRで挟まれている場合、Pトランスポゼースは両TRを認識して挟まれた領域を宿主ゲノムに挿入する。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。