miniVec™ プラスミド

VectorBuilderの独自開発miniVec™プラスミドは、最小化したバックボーンをもち、細胞治療や遺伝子治療、ワクチン製剤、食品テクノロジーにおける応用に、優れた有効性、安全性、そして高い製造効率をもたらします。従来のプラスミドと比較して、miniVec™プラスミドはプラスミド製造の収量と導入遺伝子発現が向上し、ウイルスパッケージング、CRISPRゲノム編集、トランスポゾシステムによる導入など、様々なアプリケーションにおける性能を強化するとともに、より優れた安全性プロファイルを示します。miniVec™バックボーンは、抗生物質や添加物による選択が不要であり、レンチウイルス, AAV, in vitro転写（IVT）、非ウイルス性の通常プラスミド、トランスポゾンシステムなど、多様な発現システムに応用可能です。

miniVec highlights: Efficacy, Safety & Manufacturability

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miniVec™テクノロジー

miniVec™プラスミドは、独自のminiHost™大腸菌宿主株内で機能します。このminiHost™は、SeqA配列の下流に増殖阻害遺伝子と細胞増殖をサポートするために増殖阻害物質を中和できるタンパク質をコードする解毒遺伝子の両方を含むように改変された大腸菌株です。解毒遺伝子の発現は、特定の培地添加物によって誘導可能です。

添加物を除去し、miniVec™プラスミドをminiHost™大腸菌に形質転換すると、miniVec™上に存在するSeqB遺伝子が増殖阻害転写産物のSeqA領域に相補的な短鎖非コードRNAを生成し、増殖阻害物質の翻訳を抑制され、大腸菌の増殖を可能にします。その結果、形質転換に成功した宿主大腸菌のみが強力に増殖し、miniVec™プラスミドを高コピー数で産生します。このテクノロジーにより、抗生物質や添加物の必要性が完全に不要となり、大規模な培養や製造のスケールアップが大幅に簡素化されるだけでなく、最終的な医薬品や食品の安全性が飛躍的に向上します。

Mechanism of selection with miniVec

図1. miniVec™バックボーンを用いた選択のメカニズム

プラスミド収量の大幅な増加

ラボスケールおよび産業スケールの両方の培養条件下で、miniVec™は、試験されたすべての遺伝子デリバリーシステムにおいて、従来のプラスミドと比較してプラスミド生産および製造収量を著しく向上させます。この顕著な増加は、高コピー数に適した培養、より効率的な複製、および代謝負荷の軽減など、いくつかの主要なメカニズムによるものです。

Comparison of plasmid yields from lab-scale fermentation between traditional and miniVecTM plasmids across multiple vector systems.

図2. miniVec™は、従来のプラスミドと比較してプラスミド収量の増加を示す。異なる発現システムからの従来型またはminiVec™プラスミドで形質転換された大腸菌培養物を、同じ条件下で（A）ラボスケール（200 ml）または（B）産業スケール（2.7 L）で培養した際のプラスミド収量の測定結果。

様々なベクターシステムにおける効率の向上

In vitroでの検証

miniVec™は最小限のバクテリアバックボーンであるため、哺乳類細胞における免疫応答のリスクを軽減し、宿主細胞のストレスを最小限に抑え、細胞への取り込みと輸送効率の増加を可能にしています。幅広い遺伝子デリバリーアプリケーションにおいてminiVec™を従来のバックボーンと比較しており、その結果、一貫して効率や有効性に著しい改善がみられています。

一過性発現
ウイルスパッケージング
トランスポゾンシステム
CRISPRゲノム編集

miniVecTM exhibits increased EGFP expression compared to traditional plasmids in HEK-293T cells 48 hours after equal molar transfection as measured by flow cytometry and fluorescence microscopy.

図3. 従来型およびminiVec™プラスミドを用いた一過性遺伝子発現の比較。EGFPをコードするminiVec™または従来型プラスミドを等モル量でHEK293T細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後48時間で、フローサイトメトリーによるEGFP発現測定と蛍光顕微鏡画像を撮影した。トランスフェクションコントロールとして、同一のmCherry発現プラスミドを共トランスフェクションした。MFI：すべての生細胞の平均蛍光強度

Comparison of lentivirus packaging using traditional and miniVec™ plasmids

図4. 従来型およびminiVec™プラスミドを用いたレンチウイルスパッケージングの比較。（A）同じパッケージングスケールでminiVec™パッケージングプラスミドを用いると、従来型プラスミドよりも高い機能的力価（qPCRベース）が達成された。（B）従来型とminiVec™プラスミドを用いて並行製造したレンチウイルスを等量で形質導入したHEK293T細胞におけるEGFP発現の比較。MFI：すべての生細胞の平均蛍光強度

Comparative analysis of transposition efficiency between traditional and miniVec™ plasmids for piggyBac and Sleeping Beauty systems in HEK-293T cells as measured by flow cytometry.

図5. 従来型およびminiVec™プラスミドの転移効率の比較。(A) piggyBacまたは(B) Sleeping Beautyシステムを利用したEGFPをコードする従来型またはminiVec™プラスミドをモル比等量でトランスポゼース発現ベクターと共にHEK293T細胞にトランスフェクションした。コントロールサンプル（トランスポゼース発現ベクター導入無し）で蛍光が検出できないレベルになった時点で蛍光画像を撮影し、フローサイトメトリーにより平均蛍光強度測定を記録した。

Comparison of CRISPR-mediated EGFP knockin using traditional and miniVec™ plasmids

図6. 従来型およびminiVec™プラスミドを用いたCRISPRによるEGFPノックインの比較。AAVS1遺伝子座への相同性非依存的標的挿入（HITI）によるEGFPゲノム組み込み効率を調べるため、従来型またはminiVec™を用いたhCas9発現プラスミドとEGFP発現ドナープラスミドをモル比等量でHEK293T細胞にトランスフェクションした。コントロールサンプル（空ベクターとドナープラスミド）の蛍光が検出できないレベルになった時点で、細胞の平均蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定した。

In vivoでの検証

miniVec™プラスミドよる遺伝子導入や発現効率の改善は、in vivoアプリケーションにも反映できます。miniVec™プラスミドの投与により、遺伝子導入モデルでトランスジーン発現の増加と長期化がもたらされ、ワクチン導入モデルでは急性期および長期的な免疫応答の誘導に成功しました。重要な点は、すべてのin vivo試験で物理的または生理学的な有害作用は認められなかった点で、遺伝子治療やワクチンアプリケーションにおけるminiVec™の利用への期待をさらに後押しする結果となっています。

遺伝子デリバリー
ワクチンデリバリー

Comparison of transgene expression of traditional and miniVec™ plasmids in vivo

図7. 従来型およびminiVec™プラスミドのin vivoでの導入遺伝子発現の比較。モル比等量のそれぞれのプラスミド（CAG>Luc2）をマウスに（A）静脈注射または（B）筋肉内注射により投与した。表示した投与後の日数でルシフェラーゼ発現を測定した。

Comparison of immune response to naked DNA vaccination between traditional and miniVec™

図8. COVID-19スパイクタンパク質を発現する従来型およびminiVec™プラスミド間でのネイキッドDNAワクチン接種に対する免疫応答の比較。従来型またはminiVec™を用いたワクチン、ネガティブコントロール（PBS）、またはプラスミドコントロール（空の従来型またはminiVec™プラスミド）をそれぞれモル比等量を用い、2週間間隔で3回、BALB/cマウスに筋肉内注射した。（A）各投与の2週間後、次の投与前に採取した血液中の抗原特異的抗体価を測定した。（B）42日目に脾臓細胞を採取し、スパイクタンパク質（抗原）によって刺激し、脾臓細胞の培養上清中のIFN-γ分泌量を測定した。

飛躍的に改善され、信頼できる安全性プロファイル

VectorBuilderの革新的なminiVec™プラットフォームは、細胞・遺伝子治療分野における多様なアプリケーションで実証された利点に加え、GMP医薬品製造において従来の抗生物質依存型プラスミドに代わる明らかに安全な選択肢を提供します。抗生物質残留の可能性を排除し、水平遺伝子移動のリスクを軽減し、最終製品の純度を確保することで、これを実現しています。この優れた安全性プロファイルは、複数のin vivo検証で確認されています。miniVec™プラスミドを投与した動物の毒性評価では、動物への有害事象は認められず、空のminiVec™プラスミドは免疫応答を誘発しませんでした。重要な点として、本システムの設計原則は、治療薬製造に関してFDAおよびEMAが定めた規制基準に準拠しています。