IVT RNA医薬品開発

図 1. UTR最適化によるmRNA発現の改善。様々な5'UTRと3'UTRの組み合わせによる、in vitroでガウシアルシフェラーゼ発現への影響を調査した。HEK293T細胞を12ウェルプレートに2.3x10^5細胞/ウェルの密度で播種し、1ug mRNAを添加した。トランスフェクション後6，24、48、72、96時間後に、培養液中のガウシアルシフェラーゼ活性を測定した。

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図 2. コドン最適化による、in vitroおよびin vivoでのmRNA発現量の増加。(A）HEK293T細胞におけるHiExpress™ ホタルルシフェラーゼmRNAおよび他のルシフェラーゼmRNAの発現。12ウェルプレート上で培養中の細胞を、1ウェルあたり0.5ugのmRNAでトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を6時間、24時間、48時間、72時間後に測定した。(B）成体C57BL/6マウスに30ugのLNP-mRNAを筋肉内注射し、6時間、24時間、48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。FLuc WTは野生型ホタルルシフェラーゼ、FLuc WT（co）はコドン最適化された野生型ホタルルシフェラーゼ、FLuc2はLuc2ホタルルシフェラーゼを示す。

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図 3. ポリAテールのサイズ解析。ポリAテールはリボヌクレアーゼT1を用いてIVT mRNAから切断し、オリゴdTアフィニティークロマトグラフィーで単離した。(A) 単離されたポリAテールのUrea-PAGEゲル電気泳動解析。(B)単離ポリA末端のLC-MS分析。120pmolのポリAテールを用いて、デコンボリューションしたスペクトルから、予想される120ntのサイズが確認された。(C)120ntポリAテールのサイズ分布。エラーバーはトリプリケートからの標準偏差を表す。長さび加重平均は123 ntだった。

図 4. ポリAの長さと構造の翻訳効率に対する影響。同じCap1とUTRを持つが様々なポリAテール長を持つIVT EGFP mRNAをHEK293T細胞にトランスフェクションした。

図 5. 安定性の高い10,000 ntを超えるIVT RNAの変性アガロース電気泳動像 

図 6. LC-MSで解析したIVT mRNAのキャッピング効率のLC-MS解析結果。(A)共転写法または(B)酵素法のいずれを用いても、高効率のキャッピング(>99%)が達成された。

図 7. 修飾ヌクレオチドはmRNAの発現量を増加させ、不純物であるdsRNAを低減する。(A)HEK293T細胞におけるホタルルシフェラーゼの発現。修飾ヌクレオチド（N1-メチルシュードウリジン（m1Ψ）および5-メチルシトシン（m5C））の有り/無しのmRNAを合成した。細胞は12ウェルプレートで増殖させ、1ウェルあたり1ugのmRNAをトランスフェクションした。トランスフェクション後6時間、24時間、48時間におけるHEK293T細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。エラーバーは標準偏差を示す。(B)ヌクレオチド修飾（m1Ψ）有り/無しのEGFP IVT mRNAを磁気ビーズ精製した後に不純物であるdsRNAについてドットブロットアッセイ（750 ng/ドット）で分析した。

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図 8. 精製プロセスの違いによる dsRNA 除去効率。異なる方法で精製したhSpCas9 IVT mRNAをドットブロットアッセイ（1ドットあたり1500 ng）で評価し、不純物であるdsRNAを推定した。略号 HIC, 疎水性相互作用クロマトグラフィー; IP-RP, イオンペア逆相液体クロマトグラフィー。