医薬品用RNA開発

CRISPR-Cas9は、プラスミド、組換えウイルス、gRNA-Cas9 RNP複合体、およびgRNAとCas9 IVT mRNAの混合物など、さまざまな方法で導入することが可能です 。これらの手法にはそれぞれ利点と限界があり、研究者は用途に合わせて最適な手法を選択することで、オフターゲット効果や望ましくない影響を最小限に抑えつつ、最大限の効率を得ることができます 。その中でも、IVT RNAは最も有望なアプローチの一つとして急速に台頭しています。

プラスミドは一般に、安価かつ大量に作製することが最も容易で、ケミカルトランスフェクションやエレクトロポレーションによる導入も簡便です。しかし、その導入方法から、用途は主にin vitroに限定されます 。さらに、プラスミドのトランスフェクション効率は細胞型によって大きく異なり、発現が細胞特異的なプロモーター活性に依存するため、特定のシステムでは効率が下がることがあります。そのため、プラスミドでは活性の高いプロモーターが使用される傾向にあり、Cas9の過剰発現によるオフターゲット編集や、宿主ゲノムへのプラスミドDNAのランダムな組み込みが増加する可能性があります 。

組換えウイルスは、トランスフェクションが困難な細胞にも使用でき、複数のgRNA実験用にCas9安定発現細胞株を作製できるため、CRISPRコンポーネントのもう一つの一般的な導入方法となっています 。しかし、このシステムもプラスミドと同様に、細胞型に依存するプロモーター特異性や、長期的なCas9発現によるオフターゲット効果のリスク上昇といった限界があります 。さらに、組換えウイルス、特にCas9遺伝子のゲノム挿入が起こるレトロウイルスやレンチウイルスシステムでは、挿入変異誘発のリスクが高まります 。

gRNA-Cas9 RNP複合体による導入は、転写や翻訳を必要としないため迅速な編集が可能であり、プラスミドや組換えウイルスシステムがもつ多くの制限を回避できます 。しかし、効率的な導入にはエレクトロポレーションが必要なため、この手法も主にin vitroでの利用に限られます 。この方法による編集は迅速に進行しますが、宿主細胞内でCas9が分解されるにつれて急速に減衰するため、Cas9タンパク質の有無によって大きく制限されます。

上記の手法とは対照的に、gRNAとCas9 IVT mRNAの混合物による導入は、オフターゲット効果を最小限に抑えつつゲノム編集を行うための最も効率的な手法の一つとして急速に注目されています 。gRNAとCas9 IVT mRNAは、脂質ナノ粒子（LNP）やケミカルトランスフェクション試薬に共カプセル化（co-encapsulation）して導入できるため、ゲノム挿入のリスクなくin vitroおよびin vivoの両方の用途に適応可能です 。さらに、転写を必要としないため、発現は細胞特異的なプロモーター活性に依存せず、翻訳も比較的速やかに起こるため、迅速かつ効率的な編集が可能です。RNP複合体と比較して、mRNAは細胞内でのCas9発現をより長くし、編集機能を維持します。一方で、mRNAは最終的に分解され、編集は一過性に留まるため、オフターゲット効果を抑えることができます 。

要約すると、プラスミド、組換えウイルス、およびgRNA-Cas9 RNP複合体を用いたCRISPR-Cas9の導入方法には、用途が制限されるだけでなく、効率の低さ、オフターゲット効果のリスク増大、挿入変異誘発の可能性といった欠点があります。それに対して、gRNAとCas9 IVT mRNAの混合物による導入方法は、多くの利点と制限の少なさにより、極めて効率的なゲノム編集手法として台頭しており、ゲノム編集の手段として検討すべき選択肢となります 。

CRISPRを用いたゲノム編集では、Cas9ヌクレアーゼが部位特異的なガイドRNA（gRNA）によってゲノム上のターゲット部位に誘導され、DNAを切断します 。多くの場合、簡便に遺伝子ノックアウト（KO）を作製するには、シングル（単一）gRNAとCas9を併用して二本鎖切断（DSB）を生じさせ、その後、非相同末端結合（NHEJ）によって不完全に修復させることで達成できます。NHEJの修復部位には小さな挿入や欠失（インデル）などが起きやすく、それによって恒久的な変異が生じます 。これらの変異の一部は、フレームシフトや早期の終止コドンの出現などを引き起こし、目的遺伝子（GOI）の機能を喪失させます 。

デュアルgRNAは、Cas9_D10Aニッカーゼと組み合わせて、1つの標的部位の対向する2本のDNA鎖を標的とする場合に使用できます。このアプローチでは、ニッカーゼ酵素がゲノムDNA両鎖に2種類のgRNAの誘導によってそれぞれ一本鎖ずつ切断することで、標的部位にDSBを生じさせます。この方法は、DSBの生成に両方のgRNAによるターゲティングが必要であるため、CRISPR/Cas9発現によるオフターゲット効果を低減させることができます。

デュアルgRNAは、Cas9_D10Aニッカーゼと外来性ドナーDNAテンプレートを用いて、目的の遺伝子に特定の配列変更を導入する場合（ノックインなど）にも使用できます。このアプローチでは、目的の変更箇所を挟む2つの領域に対して2種類のgRNAで相対するDNA鎖を標的とし、切断します。その後、相同組み換え（HDR）修復経路によって、切除された配列は外来性ドナーテンプレートを利用して修復されるため、ドナーテンプレートの配列（目的の配列）に置き換えられます。

LNP-mRNA、レンチウイルス、およびpiggyBacを用いたCAR-T導入システムの詳細な比較を以下の表にまとめました 。