標準プラスミドFLEX(Cre-On)条件的遺伝子発現ベクター

当社の標準プラスミドFLEX(Cre-On)条件的遺伝子発現ベクターは哺乳類細胞と生体でCreを利用した条件的遺伝子発現を実現するCre応答性FLEX (Cre-On)スイッチが組み込まれています。FLEX (Cre-On)スイッチはCre非存在下で遺伝子発現を完全に阻害し、Cre存在下では目的遺伝子の両端に配置されている2ペアのLoxPバリアント組み換え配列を利用した遺伝子方向の反転によって発現を活性化します。

FLEX (Cre-On)スイッチは2ペアのLoxPバリアント（オリジナルのLoxPと変異が導入されたLox2272）組み換え配列から構成されています。プロモーターに対して逆向き（アンチセンス方向）にクローニングされた目的遺伝子の両側にLoxPペアとLox2272ペアの片側がひとつずつ配置されています。LoxPとLox2272はLox2272‐LoxPの順番で、アンチパラレル配向で配置されます。どちらのLoxPバリアントもCreに認識されますが、同じLoxP配列間でだけ組み換えが発生します。Cre非存在条件では目的遺伝子はプロモーターに対して逆向きなので発現されません。Cre存在条件では、まずLoxPペアもしくはLox2272ペアのどちらか一方で起こった組み換えによって遺伝子の反転が起こります。遺伝子の反転によって目的遺伝子の発現が活性化されます。続いて、残り一方のペアに組み換えが起こることによってLoxPペア、Lox2272ペアの片側が取り除かれます。この結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272配列がひとつずつ残される形となり、Cre存在条件でも組み換え反応が起こることはありません。

当ベクターシステムはトランスジェニック動物の作製に特に適していますが、培養組織細胞にも利用することも可能です。当ベクターが導入されたトランスジェニック動物個体と組織特異的にCreを発現する個体を交配することで、Creとベクターの両方を受け継いだ子孫が生まれ、Creが発現かつ使用するプロモーターが活性化している細胞において目的遺伝子が特異的に発現するようになります。

当ベクターシステムを培養細胞に使用する際には、抗生物質または蛍光マーカー遺伝子を組み込むことで恒久的にベクターがゲノムに挿入されている細胞の選別が可能になります。

当ベクターシステムに関する詳細な情報については下記の論文を参照してください

当ベクターは哺乳類細胞と生体でCreを利用した条件的遺伝子発現を可能にします。初期状態では目的遺伝子が発現することはありません。しかしCreレコンビナーゼの共発現によって遺伝子方向の反転、恒久的な発現活性化が起こります。Creによる組み換え反応後、目的遺伝子の発現は使用するプロモーターの活性制御にしたがいます。

厳密な遺伝子発現切り替え：LoxP-Stop-LoxPを含む他の条件的遺伝子発現システムでは特定の条件下で低レベルの発現漏れが起こります。しかし当システムではCreによる組み換え反応前に目的遺伝子は逆向きに配置されるので、発現は完全に抑制されます。

安定した遺伝子活性化: Cre組み換え反応は目的遺伝子をプロモーターに対してセンス方向に反転します。遺伝子の反転後に続いて起こる組み換え反応によって、LoxPバリアントペアのそれぞれ片側が取り除かれます。結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272がひとつずつ配置される形になり、Cre存在条件でもこれ以上の組み換え反応が起こることはありません。組み換え反応終了後は、任意のプロモーターを使用して目的遺伝子を発現します。

簡便さ：プラスミドベクターは従来の方法によって細胞に導入されます。パッケージング操作が必要なウイルスと比べると非常に簡便です。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のベクターは全体で~30kbのDNA配列を扱うことができます。当ベクターのバックボーン部分は３kbほどですので、残りを任意の目的で使用することができます。

高レベル発現：従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法はしばしば非常に高いコピー数（数千コピー）を細胞に導入できます。これらの細胞は非常に高い発現量を持ちます。

in vivo用途に適している: 当ベクターは培養組織細胞への利用もできますが、Creによる条件的遺伝子発現を目的としたトランスジェニック動物の作製に適しています。　

ベクターDNAがゲノムへ挿入されない：培養細胞に対してプラスミドベクターを使用した場合、非常に低い頻度（細胞タイプによって10²-10⁶細胞あたり１回）でのみ宿主ゲノムへ挿入されます。薬剤耐性や蛍光マーカーがプラスミドベクターに組み込まれているならば、薬剤選択やセルソーターによって挿入が起こった細胞を選別できます。

細胞タイプが限定される：プラスミドベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存し、しばしば条件の最適化が必要です。プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプへの遺伝子導入は非常に困難になります。

導入コピー数にばらつきが大きい：細胞あたりに導入されるベクターの平均コピー数は非常に高くなりますが、ばらつきが大きくなります（ある細胞は非常に高コピー数だが、別の細胞は数コピーしかない、等）。一方でウイルスによる遺伝子導入法はこのようなばらつきは小さくなる傾向があります。

Promoter: 目的遺伝子を発現するプロモーター。

Lox2272: Creレコンビナーゼの組み換え配列。LoxP配列に二か所の塩基置換が導入されている。LoxP配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

LoxP: Creレコンビナーゼの組み換え配列。Lox2272配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

ORF: 発現させたい目的遺伝子。プロモーターの極性方向とは逆向きに配置されている。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。プロモーターの極性方向とは逆向きに配置されている。

SV40 late pA: SV40（Simian virus 40）のlateポリアデニレーションシグナル。上流遺伝子の転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）や視覚化用遺伝子（EGFPなど）、もしくはデュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。マーカー遺伝子の転写を停止する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。