キメラ Ad5/F35 アデノウィルス発現ベクター

発現ベクターの概要

アデノウィルスベクターは広範な哺乳類細胞種への高い遺伝子発現レベルを実現させるために使用され、宿主ゲノムに組み込まれることなく、エピソーマルDNAとして細胞内にとどまります。非常に高い導入効率と短期的に高レベルの発現効率が得られるため、遺伝子治療やワクチン研究に適した遺伝子導入方法です。

アデノウイルスベクターは風邪(感冒)の原因となるアデノウイルスに由来しています。野生型アデノウイルスは2本鎖線状DNAゲノムを有しています。

アデノウイルスベクターとしてはヒトアデノウィルスセロタイプ5(Ad5)が最もよく使用されていますが、Ad5の一番のデメリットはCAR (coxsackie and adenovirus receptor) を発現する標的細胞にしか感染させられないことです。

CARを発現しない、または十分量発現していない細胞へAd5ベクターを効率的に遺伝子導入することはできません。Ad5/F35ベクターはこの問題をアデノウィルスAd35由来のknobとshaft およびAd5由来の一部からなるキメラタンパク質を利用することでCAR陰性細胞にも効率よく感染、遺伝子導入できるようにしています。この方法で、CARではなくCD46をレセプターとして標的細胞に結合させることができます。その結果、 キメラAd5/F35ベクターはこれまで制限のあった組織向性(トロピズム)から、広範な組織由来の細胞(血球系細胞、幹細胞、血管系平滑筋やCAR陰性癌細胞株など)へと使用用途が広がりました。

アデノウイルスベクターは、まず、大腸菌プラスミドとして構築し、その後、パッケージング細胞へトランスフェクトします。パッケージング細胞では、2つのinverted terminal repeats (ITRs) 間にコードされたベクターDNAがウイルスにパッケージングされます。

ターゲット細胞内に運ばれたウイルスDNAは、核へと移行し宿主ゲノムへランダムに組み込まれることなく、エピソーマルDNAとしてとどまります。ベクター構築時に、2つのITR間に挿入された遺伝子は、残りのウイルスゲノムと共にターゲット細胞に導入されます。

アデノウイルスベクターはE1A, E1BおよびE3遺伝子 (delta E1 + delta E3)を欠損し、代わりにウイルス産生に必要なE1A,とE1Bはパッケージング細胞のゲノムに組み込まれています。このため、アデノウイルスベクターから産生されるウイルスは、細胞に導入されても複製はされず、安全に配慮されたシステムとなっています。

本ベクターシステムの詳細については、以下の文献をご参照下さい。

文献 トピックス
Cancer Biol Ther. 18:833 (2017) Applications of Ad5/F35 adenovirus in tumor therapy
Gene Ther. 20:1158 (2013) Ad5/F35 adenovirus enhances transduction efficiency of vascular smooth muscle cells
Gene. 285:69 (2002) Feasibility of using Ad5/F35 vectors in different cell types
Gene Ther. 8:930 (2001) Efficient infection of hematopoietic stem cells by Ad5/F35 adenovirus

キメラAd5/F35発現ベクターの特徴

本ベクターはAd35由来のknobとshaft およびAd5由来の一部からなるキメラタンパク質を包含することで、従来のAd5ベクターよりも広範な組織向性が得られ、標的細胞に十分なCARの発現がみられなくても使用可能です。ベクタービルダーでは、独自技術の改変で高力価ウイルスパッケージングを可能にし、また宿主細胞へのウイルス導入効率にも優れ、トランスジーンを高レベルで発現するように最適化を行っています。

キメラAd5/F35発現ベクターのメリット

幅広い組織指向性: 従来のAd5ベクターよりも広範な組織向性が得られ、標的細胞に十分なCARの発現がみられなくても使用可能です。Ad35由来のknob and shaft からなるキメラ繊維タンパク質を利用することでCD46を介してCAR陰性のターゲット細胞にも感染させることができます。

大きなカーゴスペース:  Ad5/F35 ベクターはAd5ベクターよりも長い遺伝子配列を挿入できるスペースがあります。 has a larger cargo carrying capacity compared to the Ad5 vector due to the presence of the smaller fiber shaft coding sequence derived from Ad35 in these vectors. Ad5/F35 ベクターでは〜8.2 kbまでの目的遺伝子や蛍光マーカー遺伝子を挿入できるスペースがあり、大抵のプロジェクトには十分な量です。

宿主ゲノムを破壊しない: 宿主細胞へ導入されたアデノウイルスベクターは、核内でエピソーマルDNAとしてとどまります。宿主ゲノムへ組み込まれないことは、ヒトへの応用には望ましく、ゲノム破壊によって引き起こされる発がんリスクを抑えることができます。

非常に高いウイルスタイター: ウイルス産生のため、パッケージング細胞にアデノウイルスベクターをトランスフェクトすると、産生されたウイルスが更にパッケージング細胞に再感染し、ウイルスが増幅されるため、非常に高い力価で回収することができます。これは、再感染によって増幅できないMMLVレトロウイルスやAAVとは異なる特徴です。ベクタビルダーのパッケージングサービスでは、10^10 plaque-forming unit(PFU/ml)以上の力価でウイルスを回収することができます。

In vitroとin vivoでの使用: 動物生体でよく使用されますが、in vitroでも効率よく導入することができます。

高い安全性: 本ベクターの安全性はウィルス産生に必要なウィルス遺伝子を除去したことで保証されています。よって本ウィルスベクターは標的細胞内では複製ができません。

キメラAd5/F35発現ベクターのデメリット

ベクターDNAの組み込みがない : アデノウイルスゲノムは導入細胞のゲノムには組み込まれません。エピソーマルDNAとして存在し、時間の経過と共に消失するため、分裂細胞では特に消失されやすくなります。 

強い免疫原性: 強い免疫反応を引き起こすため、in vivoでの使用用途には制限があります。

技術的な難しさ: アデノウイルスベクターの使用では、パッケージング細胞で生きたウイルスを作製し、ウイルス力価を測定する必要があります。これらの作業は、一般的なプラスミドのトランスフェクションに比べ、技術が必要で、時間もかかります。

本ベクターの基本コンポーネント

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 野生型ウイルスでは5’ITRと3’ITRは同じ配列で、ウイルスゲノム両端に反対の方向で配置されており、ウイルスゲノムの複製起点になります。

Ψ: ウイルスDNAをウイルスにパッケージングするために必要なアデノウイルスパッケージングシグナルです。

Promoter: 目的遺伝子を駆動するプロモーターをここに配置します。

Kozak: Kozak共通配列。真核細胞において翻訳開始を促進させるため、目的遺伝子ORFの開始コドン直前に配置します。

ORF: 目的遺伝子のOpen reading frameをここに配置します。

BGH pA: ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ付加シグナル。パッケージングにおいて、上流ORFのRNA転写を終結させます。

hPGK promoter: ヒト phosphoglycerate kinase 1遺伝子のプロモーター。下流マーカー遺伝子のユビキタスな発現を行います。 

Marker: 可視遺伝子産物 (例 EGFP). ウイルスベクターが導入された細胞の選択と可視化が可能になります。

TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase ポリA付加シグナル。パッケージングにおいて、上流ORFのRNA転写を終結させます。

ΔAd5/F35: E1A, E1BおよびE3領域を除いた、2つのITR間にあるAd5ゲノム領域の一部とAd35のfiber shaft and knob。CAR陰性細胞への感染、遺伝子導入に重要。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

pBR322 ori: pBR322の複製起点であるpBR322 oriをコードするプラスミドは、大腸菌では中程度のコピー数で保持されます。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

PacI: PacI 制限酵素部位(PacIは低頻度切断酵素で、TTAATTAAを切断します)。ベクター上の2つのPacI制限酵素部位は、効率よいパッケージングのために、ベクターを線状化し、ウイルスシークエンスからベクターバックボーンを取り除くために使用されます。