Vector Systems
アデノウイルスFLEX (Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクター
概要
アデノウイルスFLEX (Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクターはベクタービルダー社の高効率なアデノウイルスベクターシステムとCre応答性FLEX条件的遺伝子発現システムを組み合わせることによって、様々な哺乳類細胞タイプにCre応答性FLEXスイッチを導入することを可能にします。FLEX (Cre-Off)システムは2ペアのLoxPバリアント組み換え配列を目的遺伝子の両側に配置して、Cre応答性の遺伝子方向の反転によって目的遺伝子の発現を強力に不活性化します。
FLEX (Cre-Off)スイッチは2ペアのLoxPバリアント(オリジナルのLoxPと変異が導入されたLox2272)組み換え配列から構成されています。プロモーターに対して順向き(センス方向)にクローニングされた遺伝子の両側にLoxPペアとLox2272ペアの片側がひとつずつ配置されています。LoxPとLox2272はLox2272‐LoxPの順番で、アンチパラレル配向で配置されます。どちらのLoxPバリアントもCreに認識されますが、同じLoxP配列間でだけ組み換えが発生します。Cre非存在条件では使用するプロモーター活性にしたがって遺伝子が発現されます。Cre存在条件では、まずLoxPペアもしくはLox2272ペアのどちらか一方で起こった組み換えによって遺伝子のアンチセンス方向への反転が起こります。遺伝子の反転によって目的遺伝子の発現は完全に抑制されます。続いて、残り一方のペアに組み換えが起こることによってLoxPペアとLox2272ペアの片側が取り除かれます。この結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272配列がひとつずつ配置され、Cre存在条件でもこれ以上の組み換え反応が起こることはありません。
アデノウイルスベクターはE.coliプラスミドとして作製され、FLEX (Cre-Off)スイッチは2つのITR(inverted terminal repeats)のあいだにクローニングされます。次にベクターはパッケージング細胞に導入され、ITRを含むFLEX (Cre-Off)スイッチがウイルスにパッケージングされます。ウイルスが標的細胞に感染すると、ウイルスゲノムは細胞核内に侵入して宿主ゲノムへ挿入されることなくエピソームDNAとして維持されます。こうしてITRのあいだのFLEX (Cre-Off)は標的細胞に導入され、Creレコンビナーゼによる遺伝子方向の反転によって目的遺伝子の発現は不活性化されます。
アデノウイルスベクター上のアデノウイルス5型ゲノム(Ad5)はE1A、E1B、E3遺伝子を欠損しています(E1AとE1Bはウイルスの複製に必要)。その代わりにE1AとE1B遺伝子はパッケージング細胞に組み込まれています。そのため、当社のアデノウイルスベクターから作られるウイルスは複製不能(宿主細胞へ遺伝子の導入はできるが複製できない)であり、安全性が保障されています。
当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください
References | Topic |
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Proc Natl Acad Sci U S A. 91:8802 (1994) | The 2nd generation adenovirus vectors |
J Gen Virol. 36:59 (1977) | A packaging cell line for adenovirus vectors |
J Virol. 79:5437 (2005) | Replication-competent adenovirus (RCA) formation in 293 Cells |
Gene Ther. 3:75 (1996) | A cell line for testing RCA |
Gene. 216:55 (1998) | Characterization of LoxP mutants, including Lox2272 |
Nat Biotechnol. 21:562 (2003) | Development of the FLEX switch system |
J Neurosci. 28:7025 (2008) | Application of a FLEX switch system |
特長
当社のアデノウイルスFLEX(Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクターは哺乳類細胞や生体でCreを利用した条件的な遺伝子発現の抑制を可能にします。初期状態では目的遺伝子は使用するプロモーターの活性制御にしたがって発現します。しかしCreレコンビナーゼの共発現によって遺伝子の向きの反転が起こり、発現が恒久的に不活性化されます。
当ベクターはアデノウイルス5型(Ad5)を基に開発されています。E.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範な細胞タイプへの高い遺伝子導入効率および宿主ゲノムへの挿入効率を実現します。
メリット
厳密な遺伝子発現の抑制:Creによる組み換え反応よって目的遺伝子がアンチセンス方向へ反転するため、目的遺伝子の発現を完全に抑制します。
安定した遺伝子不活性化: Cre組み換え反応は目的遺伝子をプロモーターに対してアンチセンス方向に反転します。遺伝子の反転後に続いて起こる組み換え反応によって、LoxPバリアントペアのそれぞれ片側が取り除かれます。結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272がひとつずつ配置される形になり、Cre存在条件でもこれ以上の組み換え反応が起こることはありません。その結果として遺伝子発現の不活性化状態は恒久的に維持されます。
宿主ゲノムの損傷リスクが低い:宿主細胞に感染したアデノウイルスベクターは細胞核内でエピソームDNAとして維持されます。ゲノムへの挿入が起こらないために、ゲノムの損傷よる癌化の可能性が低く、ヒト生体に使用する用途に適しています。
非常に高いウイルスタイター: アデノウイルスベクターをパッケージング細胞に導入して作製したウイルスをパッケージング細胞に再感染させることでウイルスを増幅して非常に高いタイターを得られます。このような増幅はレンチウイルス、MMLVレトロウイルス、AAVなどではできません。当社のアデノウイルス作製サービスを利用していただければ、1011 PFU/ml(plaque-forming unit per ml)以上のタイターを得ることができます。
幅広い親和性:ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類動物由来の細胞に遺伝子を導入できます。ただし、いくつかの細胞タイプへの遺伝子導入は困難であることが知られています。
組み込み可能なDNAサイズが大きい:アデノウイルスゲノムのサイズ上限は5' ITRから3' ITRまでのあいだで38.7kbです。アデノウイルスの遺伝子発現やFLEX(Cre-Off)スイッチなどに必要なバックボーン部分を除くとおよそ7.4kbのDNA配列を当社のベクターに組み込むことができます。レンチウイルスベクターの組み込み可能サイズである6.3kbと比べて大きく、ほとんどの用途に十分なサイズとなります。
In vitroとin vivoで有効:レンチウイルスベクターは培養細胞と生体の両方に対して効果的です。特にCreによる条件的遺伝子発現システムが導入されたトランスジェニック動物の作製に適しています。
安全性:当ベクターからはウイルス作製に必須の遺伝子が取り除かれているため(それらの遺伝子はパッケージング細胞のゲノムに組み込まれています)、当ベクターから作られるウイルスは複製不能であり安全です。
デメリット
ベクターDNAがゲノムに挿入されない:アデノウイルスゲノムは宿主のゲノムに挿入されずにエピソームDNAとして維持されます。エピソームDNAは時間経過とともに失われます。特に増殖細胞では顕著になります。
特定の細胞タイプへの遺伝子導入が困難:アデノウイルスベクターは非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能ですが、特定の細胞タイプ(内皮細胞、平滑筋、気道上皮細胞、末梢血細胞、神経細胞、造血細胞など)に対する導入効率は低くなります。
強い免疫原性: アデノウイルスベクターから作成されたウイルスは動物生体内で強い免疫反応を引き起こすことがあるので、特定のin vivo用途には制限があります。
技術的な複雑さ:アデノウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。
基本コンポーネント
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端で逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。
Ψ: アデノウイルスゲノムDNAのパッケージングシグナル。
Promoter: 目的遺伝子発現用プロモーター。
Lox2272: Creレコンビナーゼの組み換え配列。LoxP配列に二か所の塩基置換が導入されている。LoxP配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。
LoxP: Creレコンビナーゼの組み換え配列。Lox2272配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。
Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。
ORF: 発現させたい目的遺伝子。プロモーターの極性方向と順向きに配置されている。
TK pA: 単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのポリアデニレーションシグナル。目的遺伝子の転写を停止する。
ΔAd5: アデノウイルス5型(Ad5)ゲノム。E1A、E1B、E3領域が欠損している。
3' ITR: 3' inverted terminal repeat.
pBR322 ori: pBR322複製起点。E.coliでプラスミドを中コピー数で維持する。
Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。
PacI: PacI制限酵素認識サイト(TTAATTAA)。2ヵ所のPacIサイトで切断することによってベクターを線状化し、ベクターバックボーンを取り除いて効率的なパッケージングを実現する。