shRNAターゲットデザイン

VectorBuilderのshRNAターゲットデザインツールを使用すると、ノックダウンスコアの高いショートヘアピンRNA（shRNA）をデザインして、目的の遺伝子（GOI）の効率的なノックダウンを実現できます。

VectorBuilderは、RNAiコンソーシアム（TRC）で使用されているものと同様のルールを適用して、shRNAをデザインおよびスコアリングします。与えられたRefSeqトランスクリプトごとに、候補ターゲットサイトと見なされるすべての可能な21merを検索します。同一塩基が4連続以上続く、7連続以上のGまたはC塩基、GC含量<25％または> 60％、5’末端がAAで始まることを避けるようにデザインします。ノックダウンスコアは、内部ステムループ、3 '末端に向かって高いGC含量、既知のmiRNAシード配列、または他の遺伝子とのオフターゲットの一致を含む候補に対してペナルティが課せられます。複数の転写産物（Alternative transcript）を持つ遺伝子の場合、すべての転写物を標的できるターゲットシークエンスに高いスコアが与えられます。

すべてのスコアは≥0で、平均は〜5、標準偏差は〜5、95％のスコアは≤15となっています。ノックダウンスコアが約15のshRNAは、ノックダウンパフォーマンスとクローニングのしやすさが最も優れていると見なされますが、ノックダウンスコアが0のshRNAは、ノックダウンパフォーマンスが最も低いか、クローニングが困難です。

Design by inputting target sequence

Search shRNA by gene

You can search with:

遺伝子記号 ( e.g. RHO)
正式名称 ( e.g. rhodopsin)
他名称 ( e.g. rod pigment)

NCBI Gene ID ( e.g. 6010)
mRNA RefSeq Accession ( e.g. NM_000539.3)
Protein RefSeq Accession ( e.g. NP_000530.1)

遺伝子ノックダウン

RNA干渉（RNAi）は、何十年もの間、遺伝子調節の方法として広く利用されてきた。目的の遺伝子のRNAに相補的な短いRNA配列（約21-23ヌクレオチド）が標的細胞に導入される。外来性RNA鎖は相補的な内在性mRNA鎖に結合する。細胞は二本鎖RNAを分解し、翻訳が起こらなくなり、遺伝子の発現がノックダウンされる。いくつかのmRNAは結合せず、機能的タンパク質を産生するため、このアプローチは遺伝子を完全にノックアウトするものではないことに注意することが重要である。

shRNA

一般的なRNAiアプローチの一つは、ショートヘアピンRNA（shRNA）を利用するものである。shRNAの配列は、一本の転写産物がそれ自体に折り返してハイブリダイズし、ヘアピン構造を形成するように設計されている。ループ構造を持つこの二本鎖RNA複合体は細胞質に運ばれ、そこでDicerによって処理され、RISC複合体にロードされる。RISC複合体はサイレンシングRNAと標的mRNAの結合を促進し、そこでmRNAは切断または分解される（図1）。

Production and function of forms of RNAi.

図1. RNAiの産生と機能。

なぜshRNAを選ぶのか？

単一の転写産物からヘアピン構造を形成することにより、サイレンシングの導入、期間、制御をカスタマイズすることができる。shRNA をコードするプラスミドは、トランスフェクション（例：エレクトロポーレーションやマイクロインジェクション）またはトランスダクション（レンチウイルスやアデノウイルスのようなウイルスを使用）することができる。shRNAベクターはタグをつけたり、さらにウイルスを用いてゲノムに組み込むこともでき、様々な細胞に導入することが可能である。

shRNA のデザイン

VectorBuilder の shRNAデザインツールでは、配列を入力すると、ノックダウンスコアの高い順に、可能性のある全ての shRNA 配列のリストが表示されます。VectorBuilder のアルゴリズムは各 21mer (21塩基対の配列) を取り出し、(1) クローナビリティと (2) 特異性を決定します。クローナビリティはヌクレオチドの順序と分布に影響される。リピート、GC 含量が高すぎたり低すぎたり、shRNA 配列内にステムループが形成されると安定性が低下し、ノックダウンスコアが低下する。特異性は標的遺伝子のみが影響を受けることを確実にするため、各候補配列は宿主ゲノムと比較する。目的の遺伝子の外に shRNA が結合する可能性のある領域があると、ノックダウンスコアは低下する。高いノックダウンスコアは理論的には shRNA の性能の高さを反映しているが、予期せぬ相互作用が起こることもあり、実験効率が低下する。理論的な結果が実験結果と完全に一致する保証はないため、論文では通常、2つの異なる shRNA 配列を用いた shRNA ノックダウンの確認を要求している。高いターゲティング効率を持つ2つのshRNA配列の変化を最大化するために、当社では3つのshRNA配列と1つのコントロール（スクランブル）配列を提供する3+1サービスを提供しています。

GenBank形式とFASTA形式の両方の配列を認識できる。
3'UTRをターゲットとするリターンもあるが、この領域はコード領域と同様にノックダウンに効果的である。
ノックダウンスコアは、実際の効率がスコアの予測値から大きく外れる可能性があるため、実験的に検証する必要がある。このような理由から、2つの配列を使って効果的なノックダウンが成功する可能性を高めるために、少なくとも 3つのshRNAをテストすることをお勧めします。

これらの情報の使用に起因する損害について、弊社は一切の責任を負いかねますのであらかじめご了承ください。