アデノウイルス作製サービス

アデノウイルス作製と品質検査

アデノウイルスの製造では、まず目的の遺伝子（GOI）がクローニングされたアデノウイルスベクターをPacI制限酵素処理によってリニア化（線状化）します。リニア化したベクターDNAを、アデノウイルス遺伝子E1を発現するパッケージング細胞にトランスフェクトして、組み換えアデノウイルスを生成し、細胞培養培地に放出されたアデノウイルス粒子を収集します。 超純粋アデノウイルス（in vivoグレード）の場合、ウイルス粒子は塩化セシウム（CsCl）勾配超遠心分離によってさらに精製および濃縮されます。免疫細胞学的にアデノウイルス特異的ヘキソンタンパク質を検出しウイルスタイターを測定します。超純粋グレードのアデノウイルスでは、ウイルス粒子の光学密度（OD260を使用）を測定してタイターを推定します。

図 1. Ad5アデノウイルスパッケージング工程

VectorBuilderが製造する各アデノウイルスの品質管理には、タイター測定、細菌や真菌の無菌性試験、マイコプラズマ検出試験が含まれます。アデノウイルスベクターが蛍光タンパク質をコードしている場合は、形質導入試験を行って、目的の蛍光が発現することを確認します。さらに、超純粋アデノウイルスの場合、定期的にエンドトキシンアッセイを行って、エンドトキシンレベルをチェックしています。COAへエンドトキシンアッセイ結果の記載するためには追加費用が発生します。ご希望の追加QCにも対応可能です。

実験に最適なアデノウイルスタイプを決定したいときには、FAQをご覧ください。

キメラ Ad5/F35アデノウイルス作製と品質検査

下の (図2)に示すように、キメラAd5 / F35アデノウイルス製造では、まず目的の遺伝子（GOI）を運ぶAd5 / F35アデノウイルスプラスミドDNAベクターを、制限酵素PacIでリニア（線状）化します。リニア化されたベクターDNAは、アデノウイルス遺伝子E1を発現するパッケージング細胞にトランスフェクトされて組み換えアデノウイルスを産生ます。アデノウイルス粒子は組織培養培地に放出され、回収します。 超純粋Ad5 / F35アデノウイルス（in vivoグレード）の場合、ウイルス粒子はさらに精製され、塩化セシウム（CsCl）勾配超遠心分離によって濃縮されます。培養細胞グレード（in vitroグレード）のウイルスは、免疫細胞化学的手法でアデノウイルス特異的ヘキソンタンパク質を検出し測定することで、ウイルスのタイターを求めます。超純粋Ad5 / F35アデノウイルスの場合は、ウイルス粒子の光学密度（OD260を使用）を測定してタイターを求めます。

図 2. キメラAd5/F35アデノウイルスパッケージング工程

VectorBuilderで作製した各アデノウイルスの品質管理には、タイター測定、細菌と真菌の無菌性テスト、およびマイコプラズマの検出によるデータが提供されます。そして Ad5 / F35アデノウイルスプラスミドDNAベクターが蛍光タンパク質マーカーをクローニングしている場合、作成したウイルスを培養細胞に感染させ、対応する蛍光マーカーの形質導入データを含みます。さらに、超純粋アデノウイルスは、エンドトキシンアッセイを定期的に実施して各ウイルスのエンドトキシンレベルをチェックしています。

Ad5アデノウイルス vs. キメラAd5/F35アデノウイルス

最もポピュラーなヒトアデノウイルス血清型5（Ad5）ベクターは、標的細胞に感染するためのコクサッキーおよびアデノウイルス受容体（CAR）を必要とすることが制限要因となっています。CARが発現していない、またCAR発現量が低い宿主細胞は、Ad5で効率的な形質導入が望めません。キメラAd5 / F35ウイルスベクターでは、アデノウイルス血清型35（Ad35）に由来するノブとシャフト、およびAd5に由来するファイバーテールで構成されるキメラファイバータンパク質を発現しています。そのためキメラAd5 / F35アデノウイルスでは、CARネガティブ細胞または低レベルCAR発現細胞に対しても、非CAR受容体であるCD46を介して容易に形質導入が行えます。Ad5 / F35アデノウイルスのキメラ化によって、アデノウイルスベクターの組織指向性が、造血細胞、原始幹細胞、血管平滑筋細胞、CARネガティブ腫瘍細胞などの細胞株にも拡大しました。

実験に最適なアデノウイルスタイプを決定したいときには、FAQをご覧ください。

ガットレスアデノウイルス作製と品質検査

下の図3に示すように、ガットレスアデノウイルスの作成では、まずガットレスアデノウイルスプラスミドDNAベクターの5‘-3’ITR間にプロモーター＞目的遺伝子（GOI）発現カセットをクローニングします。当社のベクターは、ビリオンが効率的にパッケージングされるように、ITR間が28kb以上となるように適切な長さのスタッファー配列をクローニングします。次に5‘-3’ITR間にあるベクター領域を制限処理によって分離し、分離したフラグメントをパッケージング細胞にトランスフェクトし、さらにヘルパーウイルスが感染することで、組み換えアデノウイルス粒子が産生されます。当社のガットレスアデノウイルスベクターシステムは、Creリコンビナーゼを安定して発現するパッケージング細胞と2つのLoxPに挟まれたパッケージングシグナルを持つヘルパーウイルスを利用して、ヘルパーウイルスパッケージングシグナルのCre媒介性切除を促進します。これにより、ヘルパーウイルスゲノムがガットレスアデノウイルスゲノムとともに産生するウイルス粒子にパッケージされることを防ぎます。パッケージング細胞で産生されたアデノウイルス粒子は細胞培養培地に放出されます。

超純粋ガットレスアデノウイルス（in vivoグレード）の場合、ウイルス粒子はさらに精製され、塩化セシウム（CsCl）勾配超遠心分離によって濃縮されます。超純粋ガットレスアデノウイルスは、ウイルス粒子の光学密度（OD260を使用）を測定してタイターを求めます。

図 3. ガットレスAd5アデノウイルスのパッケージング工程

VectorBuilderで作製した各アデノウイルスの品質管理には、タイター測定、細菌と真菌の無菌性テスト、およびマイコプラズマの検出によるデータが提供されます。アデノウイルスプラスミドDNAベクターが蛍光タンパク質マーカーをクローニングしている場合、作成したウイルスを培養細胞に感染させ、対応する蛍光マーカーの形質導入データを含みます。さらに、超純粋アデノウイルスは、エンドトキシンアッセイを定期的に実施して各ウイルスのエンドトキシンレベルをチェックしています。

Ad5やAd/F35アデノウイルスに対するガットレスアデノウイルスの優位性

ガットレスアデノウイルスベクター（別名ヘルパー依存型アデノウイルスベクター）は、従来のAd5またはキメラAd5/F35アデノウイルスベクターよりも優位な利点を持つ最新世代のアデノウイルスベクターです。ウイルスの複製とパッケージングに不可欠なシス作用エレメント以外の、ほぼ全てのウイルスゲノム配列を欠損しているため、ガットレスアデノウイルスベクターは、in vivoで使用した場合、最小限の免疫原性で、長期間の導入遺伝子発現が可能です。 したがって、Ad5またはAd5/F35と比べて安全性が大幅に改善されており、遺伝子治療薬として非常に有効な候補です。さらに、ウイルスゲノム配列を欠損しているため、最大33 kbの組み換え遺伝子の搭載能力があり、大きな遺伝子や、複数遺伝子の同時形質導入に非常に適しています。 

実験に最適なアデノウイルスタイプを決定したいときには、FAQをご覧ください。

ガットレスAd5/F35アデノウイルス作製と品質検査

下の図4に示すように、ガットレスAd5/F35アデノウイルスの作成では、まずガットレスアデノウイルスプラスミドDNAベクターの5‘-3’ITR間にプロモーター＞目的遺伝子（GOI）発現カセットをクローニングします。当社のベクターは、ビリオンが効率的にパッケージングされるように、ITR間が28kb以上となるように適切な長さのスタッファー配列をクローニングします。次に5‘-3’ITR間にあるベクター領域を制限処理によって分離し、分離したフラグメントをパッケージング細胞にトランスフェクトし、さらにヘルパーウイルスが感染することで、組み換えアデノウイルス粒子が産生されます。当社のガットレスアデノウイルスベクターシステムは、Creリコンビナーゼを安定して発現するパッケージング細胞と2つのLoxPに挟まれたパッケージングシグナルを持つヘルパーウイルスを利用して、ヘルパーウイルスパッケージングシグナルのCre媒介性切除を促進します。これにより、ヘルパーウイルスゲノムがガットレスアデノウイルスゲノムとともに産生するウイルス粒子にパッケージされることを防ぎます。パッケージング細胞で産生されたアデノウイルス粒子は細胞培養培地に放出されます。

超純粋ガットレスアデノウイルス（in vivoグレード）の場合、ウイルス粒子はさらに精製され、塩化セシウム（CsCl）勾配超遠心分離によって濃縮されます。超純粋ガットレスアデノウイルスは、ウイルス粒子の光学密度（OD260を使用）を測定してタイターを求めます。

図 4. ガットレスAd5/F35アデノウイルスのパッケージング工程

VectorBuilderで作製した各アデノウイルスの品質管理には、タイター測定、細菌と真菌の無菌性テスト、およびマイコプラズマの検出によるデータが提供されます。アデノウイルスプラスミドDNAベクターが蛍光タンパク質マーカーをクローニングしている場合、作成したウイルスを培養細胞に感染させ、対応する蛍光マーカーの形質導入データを含みます。さらに、超純粋アデノウイルスは、エンドトキシンアッセイを定期的に実施して各ウイルスのエンドトキシンレベルをチェックしています。

実験に最適なアデノウイルスタイプを決定したいときには、FAQをご覧ください。

ガットレスAd5/F35アデノウイルスのガットレスAd5アデノウイルスに対する優位性

当社のガットレスAd5/F35アデノウイルスベクターは、ガットレスアデノウイルスとAd/F35アデノウイルスの両方の利点を兼ね備えており、免疫原性の低下、長期間の導入遺伝子発現、より大きな環境収容力、より広範な感染指向性を持ちます。

ガットレスアデノウイルスベクター(別名ヘルパー依存性アデノウイルスベクター)は、従来のアデノウイルスベクターに比べていくつかの優位性を持つ最新世代のアデノウイルスベクターです。ウイルスの複製とパッケージングに不可欠なシス作用エレメント以外の、ほぼ全てのウイルスゲノム配列を欠損しているため、ガットレスアデノウイルスベクターは、in vivoで使用した場合、最小限の免疫原性で、長期間の導入遺伝子発現が可能です。したがって、Ad5またはAd5/F35と比べて安全性が大幅に改善されており、遺伝子治療薬として非常に有効な候補です。さらに、ウイルスゲノム配列を欠損しているため、最大33 kbの組み換え遺伝子の搭載能力があり、大きな遺伝子や、複数遺伝子の同時形質導入に非常に適しています。

最もポピュラーなヒトアデノウイルス血清型5（Ad5）ベクターは、標的細胞に感染するためのコクサッキーおよびアデノウイルス受容体（CAR）を必要とすることが制限要因となっています。CARが発現していない、またCAR発現量が低い宿主細胞は、Ad5で効率的な形質導入が望めません。キメラAd5 / F35ウイルスベクターでは、アデノウイルス血清型35（Ad35）に由来するノブとシャフト、およびAd5に由来するファイバーテールで構成されるキメラファイバータンパク質を発現しています。そのためキメラAd5 / F35アデノウイルスでは、CARネガティブ細胞または低レベルCAR発現細胞に対しても、非CAR受容体であるCD46を介して容易に形質導入が行えます。Ad5 / F35アデノウイルスのキメラ化によって、アデノウイルスベクターの組織指向性が、造血細胞、原始幹細胞、血管平滑筋細胞、CARネガティブ腫瘍細胞などの細胞株にも拡大しました。