レンチウイルスFLEX(Cre-Off) 条件的遺伝子発現ベクター

概要

レンチウイルスFLEX(Cre-Off) 条件的遺伝子発現ベクターはベクタービルダー社の高効率第三世代レンチウイルスベクターシステムとCre応答性FLEX条件的遺伝子発現システムを組み合わせることによって、宿主細胞ゲノムにCre応答性FLEXスイッチを恒久的に挿入することを可能にします。FLEX(Cre-Off)システムは2ペアのLoxPバリアント組み換え配列を目的遺伝子の両側に配置してCre応答性の遺伝子方向の反転によって目的遺伝子の発現を強力に不活性化します。

FLEX (Cre-Off)スイッチは2ペアのLoxPバリアント(オリジナルのLoxPと変異が導入されたLox2272)組み換え配列から構成されています。プロモーターに対して順向き(センス方向)にクローニングされた遺伝子の両側にLoxPペアとLox2272ペアの片側がひとつずつ配置されています。LoxPとLox2272はLox2272‐LoxPの順番で、アンチパラレル配向で配置されます。どちらのLoxPバリアントもCreに認識されますが、同じLoxP配列間でだけ組み換えが発生します。Cre非存在条件では使用するプロモーター活性にしたがって遺伝子が発現されます。Cre存在条件では、まずLoxPペアもしくはLox2272ペアのどちらか一方で起こった組み換えによって遺伝子のアンチセンス方向への反転が起こります。遺伝子の反転によって目的遺伝子の発現は完全に抑制されます。続いて、残り一方のペアに組み換えが起こることによってLoxPペアとLox2272ペアの片側が取り除かれます。この結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272配列がひとつずつ配置され、Cre存在条件でもこれ以上の組み換え反応が起こることはありません。

レンチウイルスベクターシステムは哺乳類細胞に遺伝子を恒久的に導入するツールとして優れています。レンチウイルスFLEX (Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクターはE.coli用プラスミドとして作製され、FLEX (Cre-Off)スイッチは2つのLTR(long terminal repeats)のあいだにクローニングされます。レンチウイルスFLEX(Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクターはヘルパープラスミドとともにパッケージング細胞に導入され、ベクター内のLTRを含むFLEX (Cre-Off)スイッチがウイルスRNAに転写されます。ヘルパープラスミドから発現したウイルスタンパク質群がウイルスRNAをウイルスにパッケージングします。こうして作られたウイルスは上清に放出され、直接もしくは濃縮した後に標的細胞への感染に用いられます。

ウイルスが標的細胞に感染するとRNAゲノムは細胞内に注入、DNAに逆転写された後に宿主ゲノムへ挿入されます。LTRを含むFLEX (Cre-Off)スイッチとウイルスゲノムは宿主ゲノムへ挿入され、恒久的に維持されます。Creレコンビナーゼ存在条件で目的遺伝子の反転が起こり、発現は不活性化されます。

当社のレンチウイルスベクターはウイルスのパッケージングや感染に必要になる遺伝子群が取り除かれています。これらの遺伝子はヘルパープラスミドから提供されます。レンチウイルスベクターによって生産されるウイルスは複製不能(細胞に感染はできるが複製はできない)なので安全です。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
J Virol. 72:8463 (1998) The 3rd generation lentivirus vectors
Nat Protoc. 1:241 (2006) Production and purification of lentiviral vectors
Gene. 216:55 (1998) Characterization of LoxP mutants, including Lox2272
Nat Biotechnol. 21:562 (2003) Development of the FLEX switch system
J Neurosci. 28:7025 (2008) Application of a FLEX switch system

特徴

レンチウイルスFLEX(Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクターは哺乳類細胞と生体でCreを利用した条件的な遺伝子発現の抑制を可能にします。初期状態では目的遺伝子は使用するプロモーターの活性制御にしたがって発現します。しかしCreレコンビナーゼの共発現によって遺伝子の向きの反転が起こり、発現が恒久的に不活性化されます。

当ベクターは第三世代レンチウイルスベクターを基に開発されています。E.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範囲な細胞タイプへの高効率なウイルスの感染、宿主ゲノムへの遺伝子挿入および高レベル発現を実現します。

メリット

厳密な遺伝子発現の抑制:Creによる組み換え反応よって目的遺伝子がアンチセンス方向へ反転するため、目的遺伝子の発現を完全に抑制します。

安定した遺伝子不活性化: Cre組み換え反応は目的遺伝子をプロモーターに対してアンチセンス方向に反転します。遺伝子の反転後に続いて起こる組み換え反応によって、LoxPバリアントペアのそれぞれ片側が取り除かれます。結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272がひとつずつ配置される形になり、Cre存在条件でもこれ以上の組み換え反応が起こることはありません。その結果として遺伝子発現の不活性化状態は恒久的に維持されます。

恒久的なベクターDNAの挿入: 従来の方法で宿主細胞へ導入されたベクターDNAはほとんどが時間経過とともに失われます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。一方でレンチウイルスベクターは宿主ゲノムへのベクターDNA挿入による恒久的な目的遺伝子の導入が可能です。

高ウイルスタイター:当社のレンチウイルスベクターは非常に高いタイターのウイルスを作製できます。当社のウイルス作製サービスを利用すれば>109 TU/mlが可能です。このレベルのタイターならば適量のウイルス上清を使うことで100%近い遺伝子導入効率が得られます。

非常に幅広い親和性:当社のウイルスパッケージングシステムはVSV-Gエンベロープタンパク質をウイルス表面に追加してあるので幅広い親和性を実現しています。その結果、すべての一般的な哺乳類細胞といくつかの非哺乳類細胞への遺伝子導入が可能です。さらに、ほとんどの哺乳類細胞タイプ(増殖・非増殖細胞、プライマリ細胞、確立された細胞株、幹細胞、分化細胞、接着・非接着細胞など)に遺伝子を導入することも可能です。従来の遺伝子導入法では難しかった神経細胞も当社のレンチウイルスベクターならば確実に遺伝子導入できます。当社のシステムを用いて作製されたレンチウイルスベクターはアデノウイルスベクター(いくつかの細胞タイプへの形質転換効率が低い)やMMLVレトロウイルスベクター(非増殖細胞の形質転換が困難)よりも広範な親和性を持ちます。

導入コピー数にばらつきが少ない:従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法は導入ベクターコピー数が細胞ごとに大きなばらつきが生じますが、一般的にウイルスによる遺伝子導入は導入ベクターコピー数が比較的に均一になります。

In vitroとin vivoで有効:レンチウイルスベクターは培養細胞と生体の両方に対して効果的です。特にCreによる条件的遺伝子発現システムが導入されたトランスジェニック動物の作製に適しています。

安全性:当ベクターの安全性はふたつの点から保証されます。ひとつめはウイルスのパッケージングと感染に必要な遺伝子群がヘルパープラスミドに移されていること、ふたつめは5' LTR-ΔU3はプロモーター活性をもたないので感染時にウイルスRNAが転写されません。そのために、複製可能なウイルスが発生する可能性はなく、当社のベクターを使用することによる健康へのリスクは最小限になります。

デメリット

組み込み可能なDNAサイズが限定的:野生株のレンチウイルスゲノムはおよそ9.2kbです。当社のベクター上でウイルスのパッケージング、感染に必要なコンポーネントに2.9kbが割り当てられ、およそ6.3kbを実験目的に利用できます。このサイズ上限を超えた場合、ウイルスタイターは劇的に減少します。通常、当社のベクターには目的遺伝子の他にもプロモーター、薬剤耐性マーカー等が組み込まれます。もし長大な遺伝子を組み込むなどの理由で総サイズが6.3kbを超えるならばウイルス生産に支障をきたすこともあります。

技術的な複雑さ:レンチウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

基本コンポーネント

RSV promoter: ラウス肉腫ウイルスプロモーター。ウイルスRNAを転写する。その後ウイルスRNAはウイルスにパッケージングされる。

5’LTR-ΔU3 : HIV-1の5‘LTR(long terminal repeat)に欠損を起こしたもの。レンチウイルス野生株の5‘LTRと3' LTRは相同配列をもつ。5‘LTRと3‘LTRはウイルスゲノムの両端に同じ向きで配置される。ウイルスゲノムの挿入過程に3‘LTRの配列は5‘LTRに上書きされる。LTRはプロモーターとポリアデニレーションシグナルの両方の機能があり、野生株では5‘LTRはウイルスゲノムを転写するプロモーターとして、3‘LTRは転写終了させるためのポリアデニレーションシグナルとして機能する。当社のベクターでは、5' LTR-ΔU3はウイルスの転写因子TatがLTRのプロモーターを活性化するために必要な配列が欠損している。しかしながら、5' LTR-ΔU3 上流のRSVプロモーターが代わりにプロモーターとして機能するため、この欠損はパッケージング時のウイルスRNAの生産に影響しない。

Ψ: ウイルスRNAのパッケージングに必要なHIV-1パッケージングシグナル。

RRE: HIV-1 Rev response element。ウイルスRNAのパッケージング時のRevタンパク質によるウイルスRNAの核外輸送に必要。

cPPT: HIV-1 Central polypurine tract。細胞感染中にウイルスゲノムの核内輸送を促進させるためのDNAフラップを形成する。ベクターの宿主ゲノムへの挿入効率を上昇させ、形質転換効率を高める。

Promoter:  目的遺伝子の発現用プロモーター。

Lox2272: Creレコンビナーゼの組み換え配列。LoxP配列に二か所の塩基置換が導入されている。LoxP配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272 配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

LoxP: Creレコンビナーゼの組み換え配列。Lox2272配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272 配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 発現させたい目的遺伝子。プロモーター方向に対してセンス方向に配置されている。

WPRE: ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子。3' LTRでのウイルスRNAの転写停止を助けることでパッケージング細胞内の機能的なウイルスRNAの量を増加させ、高ウイルスタイターを実現する。また、目的遺伝子の転写停止を助けることで発現レベルを高める役割も持つ。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子(ネオマイシン耐性など)や視覚化用遺伝子(EGFPなど)、もしくはデュアルレポーター遺伝子(EGFP/Neoなど)。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

3’LTR-ΔU3: HIV-1の3‘LTRのU3領域に欠損を起こしたもの。ウイルスベクター挿入過程で3' LTRが5' LTRを上書きするために、プロモーター不活性型の5' LTR-ΔU3が宿主ゲノムへ挿入される。3’LTR-ΔU3 のポリアデニレーションシグナルはウイルスパッケージング中と宿主ゲノムに挿入後のすべての転写反応を停止させる。

SV40 early pA: SV40(Simian virus 40)のearlyポリアデニレーションシグナル。ウイルスパッケージング時の3' LTRによるウイルスRNA転写停止を補助する。パッケージング細胞での機能的なウイルスRNAを増加させ高ウイルスタイターを実現する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。