アデノウイルスFLEX (Cre-Switch)条件的遺伝子発現ベクター

アデノウイルスFLEX (Cre-Switch)条件的遺伝子発現ベクターはベクタービルダー社の高効率なアデノウイルスベクターシステムとCre応答性FLEX条件的遺伝子発現システムを組み合わせることによって、様々な哺乳類細胞タイプで２種類の遺伝子の発現を切り替えるCre応答性FLEXスイッチを宿主細胞ゲノムに導入できます。FLEX (Cre‐switch)スイッチはアンチパラレル方向に配置された遺伝子対の両端に2ペアのLoxPバリアント組み換え配列が配置された構造をしています。片方の遺伝子の発現は活性化状態、もう一方の遺伝子発現は不活性化状態にあり、Creによる遺伝子対の反転によって両遺伝子の活性化状態が切り替わります。

FLEX (Cre‐switch)システムは2ペアのLoxPバリアント（オリジナルのLoxPと変異が導入されたLox2272）組み換え配列から構成されています。プロモーター下流の遺伝子対（遺伝子#1と遺伝子#2）の両側にLoxPペアとLox2272ペアの片側がひとつずつ配置されています。両方のLoxPバリアントはCreに認識されますが、同じLoxP配列間でのみ組み換えが発生します。LoxPとLox2272はLox2272‐LoxPの順番で、アンチパラレル配向で配置されます。遺伝子対は3’端を向かい合わせる形で逆向きに配置されており、発現用プロモーターに対して遺伝子#1はセンス方向、遺伝子#2はアンチセンス方向をとります。Cre非存在条件では使用するプロモーターの活性制御にしたがって遺伝子#1が発現されますが、遺伝子#2はアンチセンス方向をとっている為に発現しません。Cre存在条件では、まずLoxPペアもしくはLox2272ペアのどちらか一方で起こった組み換えによって遺伝子対の反転が起こります。遺伝子対の反転の結果、遺伝子#1はアンチセンス方向となり発現は不活性化され、遺伝子#2がセンス方向になることで発現が活性化されます。

アデノウイルスベクターはE.coliプラスミドとして作製され、FLEX (Cre‐switch)は２つのITR（inverted terminal repeats）のあいだにクローニングされます。次にベクターはパッケージング細胞に導入され、ITRを含むFLEX (Cre‐switch)がウイルスにパッケージングされます。ウイルスが標的細胞に感染すると、ウイルスゲノムは細胞核内に侵入して宿主ゲノムへ挿入されることなくエピソームDNAとして維持されます。こうしてITRのあいだのFLEX (Cre‐switch)は標的細胞に導入され、Creレコンビナーゼ存在条件で遺伝子対の反転が起こる結果、遺伝子#1はアンチセンス方向となり発現は不活性化され、遺伝子#2がセンス方向になることで発現が活性化されます。

アデノウイルスベクター上のアデノウイルス5型ゲノム（Ad5）はE1A、E1B、E3遺伝子を欠損しています（E1AとE1Bはウイルスの複製に必要）。その代わりにE1AとE1B遺伝子はパッケージング細胞に組み込まれています。そのため、当社のアデノウイルスベクターから作られるウイルスは複製不能（宿主細胞へ遺伝子の導入はできるが複製できない）であり、安全性が保障されています。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

当社のアデノウイルスFLEX(Cre-Switch)条件的遺伝子発現ベクターは哺乳類細胞と生体でCreを利用して2つの遺伝子の発現状態を条件的に切り替えることができます。使用するプロモーターの活性制御にしたがって遺伝子は発現され、Creレコンビナーゼの共発現によって２つの遺伝子の発現状態の恒久的な切り替えが起こります。

当ベクターはアデノウイルス５型（Ad5）を基に開発されています。E.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範な細胞タイプへの高い遺伝子導入効率および宿主ゲノムへの挿入効率を実現します。

厳密な遺伝子発現切り替え: 対となる遺伝子（遺伝子#1と遺伝子#2）は逆向きに配置されているため、センス方向にある遺伝子が発現する一方、アンチセンス方向にある遺伝子の発現は完全に抑制されます。

宿主ゲノムの損傷リスクが低い：宿主細胞に感染したアデノウイルスベクターは細胞核内でエピソームDNAとして維持されます。ゲノムへの挿入が起こらないために、ゲノムの損傷よる癌化の可能性が低く、ヒト生体に使用する用途に適しています。

非常に高いウイルスタイター: アデノウイルスベクターをパッケージング細胞に導入して作製したウイルスをパッケージング細胞に再感染させることでウイルスを増幅して非常に高いタイターを得られます。このような増幅はレンチウイルス、MMLVレトロウイルス、AAVなどではできません。当社のアデノウイルス作製サービスを利用していただければ、10¹¹ PFU/ml（plaque-forming unit per ml）以上のタイターを得ることができます。

幅広い親和性：ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類動物由来の細胞に遺伝子を導入できます。ただし、いくつかの細胞タイプへの遺伝子導入は困難であることが知られています。

組み込み可能なDNAサイズが大きい：アデノウイルスゲノムのサイズ上限は5' ITRから3' ITRまでのあいだで38.7kbです。アデノウイルスの遺伝子発現やFLEX(Cre-Switch)などに必要なバックボーン部分を除くとおよそ7.4kbのDNA配列を当社のベクターに組み込むことができます。レンチウイルスベクターの組み込み可能サイズである6.3kbと比べて大きく、ほとんどの用途に十分なサイズとなります。

In vitroとin vivoで有効：レンチウイルスベクターは培養細胞と生体の両方に対して効果的です。特にCreによる条件的遺伝子発現システムが導入されたトランスジェニック動物の作製に適しています。

安全性：当ベクターからはウイルス作製に必須の遺伝子が取り除かれているため（それらの遺伝子はパッケージング細胞のゲノムに組み込まれています）、当ベクターから作られるウイルスは複製不能であり安全です。

ベクターDNAがゲノムに挿入されない：アデノウイルスゲノムは宿主のゲノムに挿入されずにエピソームDNAとして維持されます。エピソームDNAは時間経過とともに失われます。特に増殖細胞では顕著になります。

特定の細胞タイプへの遺伝子導入が困難：アデノウイルスベクターは非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能ですが、特定の細胞タイプ（内皮細胞、平滑筋、気道上皮細胞、末梢血細胞、神経細胞、造血細胞など）に対する導入効率は低くなります。

強い免疫原性: アデノウイルスベクターから作成されたウイルスは動物生体内で強い免疫反応を引き起こすことがあるので、特定のin vivo用途には制限があります。

技術的な複雑さ：アデノウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端で逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

Ψ: アデノウイルスゲノムDNAのパッケージングシグナル。

Promoter:  目的遺伝子発現用プロモーター。

Lox2272: Creレコンビナーゼの組み換え配列。LoxP配列に二か所の塩基置換が導入されている。LoxP配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

LoxP: Creレコンビナーゼの組み換え配列。Lox2272配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272 配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF #1: 遺伝子#1。センス方向に配置され、Creによる組み換え反応前に発現する。

ORF #2: 遺伝子#2。アンチセンス方向に配置され、Creによる組み換え反応後に発現する。

TK pA: 単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのポリアデニレーションシグナル。目的遺伝子の転写を停止する。

ΔAd5: アデノウイルス5型（Ad5）ゲノム。E1A、E1B、E3領域が欠損している。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

pBR322 ori: pBR322複製起点。E.coliでプラスミドを中コピー数で維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

PacI: PacI制限酵素認識サイト（TTAATTAA）。2ヵ所のPacIサイトで切断することによってベクターを線状化し、ベクターバックボーンを取り除いて効率的なパッケージングを実現する。