shRNA遺伝子KDソリューションズ

shRNAを介した遺伝子ノックダウン

ショートヘアピン RNA（shRNA）は、ステムループ構造を持つ RNA 分子であり、相補的な塩基対形成を介して標的mRNAを分解できるため、様々な RNAi アプリケーションに広く利用されています。 shRNAは2本鎖DNAベクターを用いて、トランスフェクションやウイルス感染などの手法で、細胞に導入することができます。 shRNAベクターをplasmid DNAやウイルスを使って細胞に遺伝子導入を行うと、まず核内でshRNAが転写され、①センス鎖（サイレンシングされるmRNAと同じ配列）、②一本鎖ループ、③アンチセンス鎖（センス鎖に相補的な配列）で構成されるヘアピン構造が形成されます。転写されたshRNAは核外へ移行し、細胞質でDicerによるプロセッシングをうけてRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）内に取り込まれ、標的mRNAを認識し、分解します（図１）。 

図 1 . U6-ベースと miR-ベースの shRNAを介した遺伝子発現ノックダウン

shRNAを介した遺伝子ノックダウンは、従来のsmall interfering RNA（siRNA）よりも優れた点が多いため、現在では多くの RNAi アプリケーションでshRNAが利用されています。

siRNAを介した遺伝子ノックダウンとshRNAを介した遺伝子ノックダウンの特長を、以下の表にまとめます。

shRNAの発現を調節するには

shRNA発現ベクターは、U6ベースおよびmiRベースの2タイプがよく使用されています。U6ベースでは、U6プロモーターなどのRNAポリメラーゼIIIプロモーターでステムループ型shRNAを発現させます。一方、miRベースでは、RNAポリメラーゼIIプロモーターで、miR配列を付加したshRNAを発現させます。miR由来の配列はprimary miRNAと同様のメカニズムでプロセッシングされshRNAが生成されます。いずれのベクターから発現させても、細胞内では同様のメカニズムで、最終的にmiRNAにプロセッシングされ、標的遺伝子の発現を抑制します (図 1)。

miRベースのベクターでは、RNAポリメラーゼIIプロモーターを使用するため、任意のプロモーターによって、様々なアプリケーション（組織特異性、発現誘導性、および発現強度）で発現させることが可能です。miRベースのベクターには、この他にも優れた点がいくつかあります。1つ目は、複数のshRNAを1つのポリシストロンで発現できる点です。細胞内プロセッシングによって、単一の転写産物から複数の成熟shRNAを生成させることができるため、同時に複数の遺伝子をノックダウンしたり、同一遺伝子内の複数の領域をターゲットとすることができます。2つ目は、shRNAとタンパク質を1つのポリシストロンで発現できる点です。タンパク質とshRNAの共発現が必要な場合に使用できることに加え、タンパク質にマーカーを選択すれば、shRNAの転写を直接モニターすることも可能です。

miR ベースのベクターではshRNA の発現をフレキシブルに制御することができますが、より強力にノックダウンできるのはU6 ベースのベクターであることが多いようです。したがって、miRベースのベクターを使用する必要がない限り、通常、遺伝子ノックダウン実験には、U6ベースのベクターの使用をお考えください。

下の表にU6ベースのベクターとmiRベースのベクターの特長をまとめています:

実験による検証

当社のレンチウイルスU6型shRNAノックダウンベクターは図2にあるように、高効率な遺伝子ノックダウンが可能です。ここではU6型とmiR30型shRNAシステムの比較もしています。

図2　U6型とmiR30型shRNAレンチウイルスシステムを使用した、EGFPノックダウン効率の比較。

(A) U6プロモーターから発現するshRNA、CMVプロモーターから発現するmiR30 shRNA、もしくはCMVプロモーターから発現するmiR30 クアッドshRNAが組み込まれたレンチウイルスベクターをウイルスにパッケージングした。EGFPを発現するHEK293T細胞にレンチウイルスに感染させたのち、薬剤選択の前と後におけるEGFP発現量をフローサイトメトリーによって測定した。(B) 薬剤選択の前のEGFP発現量は、U6型shRNAでは~46％の減少(P<0.001)、CMVプロモーターから発現するmiR30型shRNAで13％の減少(P<0.001)、CMVプロモーターから発現するmiR30型クアッドshRNAで44%の減少(P<0.001)がみられた。(C) 薬剤選択後のEGFP発現量は、U6型shRNAでは~72％の減少(P<0.001)、CMVプロモーターから発現するmiR30型shRNAで60％の減少(P<0.001)、CMVプロモーターから発現するmiR30型クアッドshRNAで67%の減少(P<0.001)がみられた。相対EGFP発現量は感染細胞の蛍光強度の中央値(MFI：median fluorescence intensities)を非感染細胞の中央値で割ることによって計算された。実験は3回繰り返され、標準偏差は図内で記載している。p値はTukey検定から算出した。

shRNAデータベース

VectorBuilderのshRNAベクターデザインツールは、主要な生物種に対して最適化されているshRNAデータベースに直結しています。そのため、目的遺伝子に対して高いノックダウン効率をもつshRNAを簡単にストレスフリーにベクターにデザインすることができます。shRNAsの設計には RNAi コンソーシウムAllと同等のルールを採用しています。スコアーは全て0点以上（≥0）、平均値は~5点、標準偏差は~5、および95%のスコアーは15点以下（≤15）となります。ノックダウンスコアが最高の15点の時、ノックダウン効率は最高で、最低の0点時、ノックダウン効率は最低になります。ベクター構築には、ノックダウンスコアがなるべく15点に近いshRNAを使用します。

VectorBuilderのオンラインベクターデザインプラットフォームでは、遺伝子名を入力するだけで、データベース上にある、すべてのshRNA情報が検索でき、簡単にベクターをデザインすることができます。各shRNAはUCSCゲノムブラウザにリンクされているるため、ゲノム上、およびすべてのトランスクリプトのアイソフォーム上におけるシークエンス情報が確認できます。当社データベースでは、ノックダウンスコアの高い順にshRNAをランク付けしています。初めてノックダウン実験を行うときは、上位3位のshRNAでテストしてみることを推奨しています。しかしノックダウンスコアは、あくまでも目安で、低スコアのshRNAでも高いノックダウン効率が得られる場合もあり、実際のノックダウン効率は、スコアが予測したものとは大きく異なる可能性もあるので注意が必要です。すでに論文で報告され、効果の認められているターゲットシークエンスがある場合は、そちらを使う方が結果への近道です。また、3'UTRをターゲットにしても、コーディング領域をターゲットにした場合と同じ効果が得られる場合もあります。

VectorBuilderのオンライン “リソース” には、shRNAを介したRNAi 実験の計画・実施、さらにトラブルシューティングに関する豊富な情報をご提供しています。