shRNA遺伝子ノックダウンソリューション

RNA干渉（RNAi）は広く用いられている遺伝子調節法であり、目的遺伝子のRNAに相補的な短いRNA配列（約21〜23ヌクレオチド）を標的細胞に導入します。導入RNAと相補的な内因性mRNAが結合して形成された二本鎖RNAが細胞によって分解された結果、翻訳が阻止されて遺伝子発現が減少します。この方法では、未結合のmRNAが機能性タンパク質を産生し続けるため、遺伝子を完全にノックアウトすることはありません。

一般的に使用されるRNAiには、ショートヘアピンRNA（shRNA）と小分子干渉RNA（siRNA）の2つがあります。shRNAはDNAにコードされたヘアピン構造で、高い安定性を持ち長期的なノックダウンを可能にします。一方、siRNAは短鎖の合成RNAであり、細胞に直接導入されて一過性のノックダウンを行います。siRNA法と比べていくつかのメリットがあるため、ほとんどのRNAi用途ではshRNAによる遺伝子ノックダウンが好まれています。

shRNAは、ウイルスまたは非ウイルス性のDNAベクターを用いて標的細胞に導入できます。細胞にshRNAベクターをトランスフェクションまたはトランスダクションすると、核内でshRNAが転写され、ノックダウン標的mRNAと同じ配列のセンス鎖（図1のピンクの鎖）、それに続く一本鎖のループ、およびセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖（図1の青緑の鎖）からなるヘアピン構造が形成されます。転写されたshRNAは核を出て、細胞質でDicerによってプロセシングされた後、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に取り込まれ、標的mRNAの認識と分解が行われます（図1）。

図1. RNAiの生成および機能。

ベクターからのshRNA発現制御には、2つのアプローチが広く用いられています。U6型のshRNA発現とmiR型のshRNA発現です。U6型のshRNAベクターは、U6などのRNAポリメラーゼIIIプロモーターによって転写されるシンプルなステムループ構造のshRNAを発現させます。一方、miR型のshRNAベクターは、RNAポリメラーゼIIプロモーターの下でマイクロRNAスキャフォールド（骨格）を適用したshRNAを発現させるために使用されます。U6型とmiR型のどちらのshRNAも、細胞質内では同様のメカニズムでプロセシングされ、最終的に標的遺伝子のサイレンシングに至ります。しかし、miR型のshRNAはU6型のものとは異なり、構造内に内因性miR由来の配列が含まれているため、核内で転写された後にプライマリーmiRNAと同様のメカニズムでプロセシングされます（図2）。

図2. U6およびmiR型のshRNAによる遺伝子発現ノックダウンメカニズム。

miR型のshRNAベクターでは、RNAポリメラーゼIIプロモーターを使用することで、組織特異的、誘導型、または強い/弱い活性をもつプロモーターの利用が可能になり、ユビキタスなU6プロモーターでは不可能な実験用途に対応できます。さらに、miR型のshRNAシステムにおいてPol IIプロモーターが長い転写産物を効率的に産生できることは、他のノックダウンベクターシステムに対していくつかのメリットをもたらします。複数のshRNAmiRを単一のポリシストロンとして転写し、細胞内でプロセシングして複数の成熟shRNAを形成させることができます。これにより、単一のベクターを使用して複数の遺伝子をノックダウンしたり、同一遺伝子内の異なる領域を標的にしたりすることが可能になります。また、このシステムでは、ユーザーが選択した遺伝子をshRNAmiRと同じポリシストロン内に配置できます。図4に示すように、マーカー遺伝子を使用すればこのマーカーをshRNA転写の直接的なモニタリングに使用できます。また、ORFとshRNAの共発現を必要とする別用途に利用することも可能です。図3はU6型とmiR型のshRNAシステムの実験を比較しています。薬剤選択の前後のいずれにおいても、ノックダウン効率はmiR型システムで一つ以上のshRNAを使用した場合よりも、U6型システムの方が高くなります。

下の表は、U6型およびmiR型shRNAベクターシステムをまとめたものです。

VectorBuilderのデザインプラットフォームでは、オンラインshRNAデザインツールに搭載されたアルゴリズムを利用して、効果の高いshRNAベクターをデザインできます。このツールは主要な種に最適化されたshRNAデータベースを備えており、標的遺伝子に対して高いノックダウン効率を持つshRNAをデザインできます。shRNAのデザインにあたっては、RNAiコンソーシアムで使用されているものと同様のルールを適用しています。各RefSeq転写産物に対し、標的候補部位となり得るすべての21merを探索します。4連続以上の同一塩基、7連続以上のGまたはC塩基、GC含有率が25%未満または60%超、5'末端のAAなど、ノックダウン効率や特異性、あるいはクローニング難易度を上昇させると考えられる特徴を持つ候補は除外されます。すべてのスコアは0以上で、平均は約5、標準偏差は約5、95%のスコアは15以下になります。ノックダウンスコアが～15のshRNAは、最高のノックダウン性能とクローニング適性を持つと予測され、スコア0のshRNAは、ノックダウン性能が最低であるかクローニングが困難であると予測されます。

VectorBuilderのshRNAデザインツールでは、データベースから標的遺伝子を検索できます。遺伝子名を入力すると、データベース内の遺伝子を標的とするすべてのshRNAの詳細情報が表示されます。これには、shRNA配列や全トランスクリプトアイソフォームを確認するためのUCSC Genome Browserへのリンクも含まれます。またデータベースは標的遺伝子に対するすべてのshRNAをノックダウンスコアの高い順にランク付けし、上位3つの推奨shRNAを提示します。なお、ノックダウンスコアはあくまで理論上の指標です。実際のノックダウン効率は予測スコアと大きく異なる場合があるため、スコアの低い標的部位でも良好に機能する可能性があります。