レンチウイルス作製サービス

図 1. HEK293T細胞への組換えレンチウイルスの形質導入実験EGFPまたはmCherryをレポーターとする遺伝子発現ベクター、ガイドRNA発現ベクター、またはshRNA発現ベクターをパッケージングした組換えレンチウイルスをHEK293T細胞に導入した。形質導入48時間後に取得した画像を示す。

図 2. レンチウイルスハイスループットgRNAライブラリーはin vitroで効率的な形質導入を示す。 (A）96ウェルプレートに配列したライブラリーのレンチウイルスのタイター（力価）をp24 ELISAで定量した（各点が個々のレンチウイルスを示す）。(B）レンチウイルスライブラリーを用いたHEK293T細胞への形質導入。HEK293T細胞をレンチウイルスgRNAライブラリーを配列させた96ウェルプレートにて培養してレンチウイルスを感染させた (MOI 10)。導入後48時間のGFP発現の画像を示す。

図 4. All-in-oneレンチウイルスCRISPRシステムによる高効率遺伝子編集。(A）Cas9:T2A:PuroおよびEGFP-targeting gRNAまたはスクランブルgRNAを発現するレンチウイルスベクターをパッケージングし、MOI 10または50でEGFPを安定発現するHEK293T細胞に形質導入した。形質導入された細胞を選別するために、抗生物質（ピューロマイシン）選択を行い、EGFP発現を顕微鏡（100倍）で観察した。(B）非導入細胞（NC）、スクランブルgRNAまたはEGFP-targeting gRNA（EGFP-1、EGFP-2）で形質導入した細胞のゲノムDNAからgRNA標的領域をPCRで増幅し、T7E1アッセイを用いて遺伝子編集の有無を確認した。(C）EGFP陽性細胞はフローサイトメトリーを用いて定量した。(D）MOI10または50のレンチウイルスを用いた編集後、EGFP陽性細胞の比率はそれぞれ28-32％または8-14％に減少した。統計解析はANOVAとDunnettのpost hoc testを用いて行った。***P<0.001 vs gRNAスクランブルコントロール。

図 5. レンチウイルスを用いたCRISPRaによる遺伝子発現の増強。SAM複合体、dCas9/VP64、およびMS2/P65/HSF1を安定発現するNIH3T3細胞を、msgRNA発現レンチウイルスで形質導入し、抗生物質にて導入細胞を選択した。(A）SAMシステムが制御する転写活性化の図。(B）マウスBrn2遺伝子のプロモーター領域を標的としたmsgRNAの設計図。(C）スクランブルまたはターゲティングmsgRNAで形質導入したNIH3T3細胞、あるいは非導入細胞コントロール（NC）におけるBrn2の相対的遺伝子発現をqRT-PCRで測定した。Mean±SD, *P<0.05, ANOVA with Tukey's post hoc test.

図 6. レンチウイルスを用いたCRISPRiによる遺伝子発現の抑制。dCas9/KRAB/MeCP2転写抑制複合体を安定発現するJurkat細胞に、gRNA発現レンチウイルスを導入し、抗生物質で導入細胞を選択した。 (A）ヒトCXCR4遺伝子のプロモーター領域を標的としたgRNA設計図。(B）スクランブルもしくはターゲティングgRNAを形質導入した、または非導入対照（NC）のJurkat細胞におけるCXCR4タンパク質発現レベルをウェスタンブロット法で解析した。(C）スクランブルまたはターゲティングgRNA導入細胞または非導入対照（NC）細胞における相対的CXCR4遺伝子発現量をqRT-PCRにより定量した。データは平均±SDで示した。統計解析はANOVAとTukeyのpost hoc testを用いて行った。***p<0.001、***p<0.0001。(D）スクランブルまたはターゲティングgRNAで形質導入したJurkat細胞におけるCXCR4の細胞表面発現レベルをフローサイトメトリーで解析した。CXCR4発現は、モノクローナル一次抗体と蛍光標識二次抗体と反応させて検出した。無処理細胞（Unlabeled）と二次抗体のみを反応させたJurkat細胞 (2nd Ab only) をコントロールとした。データは平均値±SD。