CRISPRライブラリー構築サービス
ベクタービルダーは大規模な遺伝子機能スクリーニングを可能にする様々な要件を満足するようにカスタマイズされたライブラリー構築において豊富な経験をもちます。CRISPRライブラリーは、大腸菌グリセロールストック、プラスミドDNA、または組換えウイルスとして納品することができます。次世代シークエンシング（NGS）によるカスタムライブラリーの徹底的な検証を行い、納品時にライブラリーの品質に関する正確な情報を提供します。
特長
- 幅広い仕様に対応: 数百から最大106までの多様なCRISPRライブラリーを構築可能です。
- 豊富なCRISPR技術の経験に基づいたサポート: CRISPRノックアウト（シングルまたはデュアルgRNA）、CRISPRa、CRISPRi、シングルセルCRISPR、CRISPRバーコーディングなど、あらゆる種類のスクリーニングに対応したライブラリーの構築における豊富な経験を共有します。
- 無制限にカスタマイズ可能なベクターデザイン: 要望に応じて導入方法、プロモーター、マーカー、バーコードなどのベクターデザインを完全にカスタマイズすることが可能です。
- 高品質ウイルスパッケージング: 短い作業日数と手頃な価格で様々なウイルスシステムへのパッケージングを提供します。
- 高いカバレッジと均一性: 弊社のライブラリーは設計されたgRNAの98%以上のカバレッジを達成可能です。
サービス詳細
価格と作業日数 プライスマッチ
表1. 各サービスの価格と作業日数
| サービス | 概要 | 価格 (税別、送料別) | 作業日数 |
|---|---|---|---|
| ライブラリーの設計 | CRISPRスクリーニングのためのライブラリーベクター設計、およびターゲット遺伝子のgRNA配列設計 | 無料 | 1-4日 |
| プール型ライブラリーのクローニング（オリゴ合成とNGS検証を含む） | ガイドRNA合成、ライブラリーベクターへのgRNAの大量並列クローニング、サンガーシーケンスによる予備検証、NGSによる完全検証を含む。納品物は大腸菌グリセロールストック中のライブラリーとNGSレポートが含まれる。詳細は下記表2を参照 | ||
| プール型ライブラリーのウイルスパッケージング | ウイルスパッケージングサービスの詳細はこちらをご覧ください。ライブラリープラスミドのパッケージング価格は、通常のベクタープラスミドのパッケージング価格の1.5倍となります。 | ||
| スクリーニングサンプルのNGSデコンボリューション | スクリーニングから得られた細胞のゲノムDNAからのNGSライブラリーの作成、Illuminaシークエンス(500x以上のカバレッジ)およびデータ解析を含む。 | サンプル当たり65,100円から | 3-5週 |
表2. ライブラリーの複雑性に応じたクローニング価格対応表
| ライブラリーの複雑性 | 価格 (税別、送料別) | 作業日数 |
|---|---|---|
| シングルgRNA | ||
| <5x103 | 356,500円から | 5-8週 |
| 5x103 ~ 1x104 | 697,500円から | |
| 1x104 ~ 5x104 | 852,500円から | 6-10週 |
| 5x104 ~ 1x105 | 1,162,500円から | |
| >1x105 | お問い合わせください | |
| デュアルgRNA | ||
| <5x103 | 511,500円から | 9-13週 |
| 5x103 ~ 1x104 | 1,007,500円から | |
| 1x104 ~ 5x104 | 1,240,000円から | |
| 5x104 ~ 1x105 | 1,550,000円から | |
| >1x105 | お問い合わせください | |
技術情報
CRISPRスクリーニングストラテジー
プール型CRISPRライブラリーは、特定のシグナル経路、疾患、薬物に対する細胞の反応、発生過程、遺伝子制御などに関与する遺伝子領域やノンコーディング領域を大規模（あるいは全ゲノム）な機能スクリーニングを実行できる強力なツールとなります。以下の表3は、一般的に使用されているCRISPRベースのスクリーニング法の一覧となります：
表3. CRISPRスクリーニング手法の比較
| スクリーニング手法 | 機構 | 標的領域 | アプリケーション |
|---|---|---|---|
| CRISPR KO | 野生型Cas9またはCas9ニッケースがDNAを切断し、細胞によるDNA切断の修復時に標的部位にランダムな変異が導入される | 主にコーディング領域 | コーディング遺伝子の機能スクリーニング |
| CRISPRa | 不活性型Cas9（dCas9）と転写活性化因子（例、VP64）の融合タンパク質がgRNA標的部位近傍の遺伝子発現を活性化する | 通常、プロモーター領域とその他の非コード制御領域 | 遺伝子の機能獲得スクリーニング、または非コーディング領域の制御機能スクリーニング |
| CRISPRi | 不活性型Cas9（dCas9）と転写抑制因子（例、KRAB）の融合タンパク質がgRNA標的部位近傍の遺伝子発現を抑制する | 通常、プロモーター領域とその他の非コード制御領域 | 遺伝子の機能欠損スクリーニング、または非コーディング領域の制御機能スクリーニング |
実験データ
図1. ベクタービルダーで構築したCRISPRライブラリーのサイズ、カバレッジ、アライメント率。(A) 製造したライブラリーの複雑さは102から>105の範囲となり、非常に多岐にわたる。(B)gRNAのカバレッジとリードのアラインメント率はともに非常に高く、我々のライブラリーのカバレッジとエラー率の低さが際立つ。
図2. 7.7x104種のgRNAをもつプール型ライブラリーにおけるgRNAの分布。gRNAリードカウントはNGSライブラリーサイズ（1,000万リード）で正規化し、log2スケールでプロットした。NGSシーケンス深度は ｘ300。
注文方法
お客様提供のプラスミドライブラリー
お客様によって作製されたライブラリーDNAを使用する場合は、マテリアル提出ガイドラインにしたがってライブラリーDNAを郵送してください。作業遅延やライブラリーのダメージを避けるために、当社のガイドラインに忠実に従った梱包をお願いいたします。お客様から提供されたすべてのマテリアルは、必ずベクタービルダーによる品質検査を受ける必要があり、マテリアル当たり16,000円の検査費用が発生します。マテリアルが品質検査を通過しないとライブラリー構築が開始できないことをご承知おきください。お客様によって作製されたプラスミドライブラリーからライブラリー構築をする場合、当社で最終的なライブラリーの複雑性と均一性の保証はいたしかねます。
FAQ
デュアルgRNAライブラリーは、シングルgRNAライブラリーよりもはるかに強力なノックアウトスクリーンが可能です。なぜなら、デュアルgRNAライブラリーは標的配列に大きな配列欠失を導入できるため、機能喪失突然変異の発生効率がはるかに高いからです。デュアルgRNAライブラリーの各CRISPRベクターには、同じ遺伝子を標的とする一対のgRNAが含まれます。デュアルgRNAライブラリーがCas9を発現する細胞に導入されると、各ベクターは同じ標的遺伝子に2つの切断を作り出し、細胞が2つの切断部位の壊れた末端を修復しようとすると、2つの標的部位にまたがる大きな欠失が生じます。Cas9/gRNAによる２つの切断部位は、標的遺伝子の機能的に重要な領域を挟むようにデザインされているので、この2つの部位にまたがる欠失は遺伝子機能の喪失につながる可能性が高まります。
典型的なノックアウトスクリーニングの場合、プール型CRISPRライブラリーは1ベクターシステムまたは2ベクターシステムのどちらの形式でも構築できます。1ベクターシステムではCas9またはCas9バリアントは同じベクターからgRNA（複数可）と共発現されます。2ベクターシステムではCas9またはCas9バリアントとgRNA（複数可）は2つの別々のベクターから発現されます。2ベクターシステムでは、gRNA発現ベクターをCas9安定的発現する細胞株に導入するオプションも選択できます。1ベクターシステムの利点は、細胞への2つの異なるベクターの共導入／トランスダクションを回避できること、およびCas9発現安定細胞株の入手可能性に制限されないことです。しかし、2ベクターシステムに比べると汎用性が低く、クローニングやウイルスパッケージングの効率が劣ることがあります。
ベクタービルダーはgRNA特異性スコアの計算にCRISPRライブラリーデザイン（CLD）のアルゴリズムを使用しています。 ある生物のN(20)NGG配列を標的とするgRNAを例にとると、ゲノム内で標的配列と3つ以下のミスマッチを持つ潜在的なオフターゲット配列すべてを検索します。次にそれぞれの潜在的なオフターゲット配列について、オフターゲットスコアが計算されます。すべてのオフターゲットスコアを集計して最終的なgRNAの特異性スコアを算出します（0から100までで数字が大きいほど高い特異性を示す）。 特異性スコアは大まかな指標に過ぎないことに留意してください。実際の効率性や特異性はスコアが予測するものとは異なる可能性があります。スコアの低いgRNAでもうまく機能することもあります。