カスタムベクター構築サービス

VectorBuilderでは様々な分子生物学技術を組み合わせて、ユーザーの要求を満足させるカスタムベクターを受託構築しています。発現ベクターは通常、Gateway cloningまたはGibson assemblyを使用して構築します。shRNAおよびgRNAベクターは、ライゲーションベースのアプローチを使用してクローニングされ、高度に最適化されたハイスループットクローニングプラットフォームを利用して、目的のベクターを最低価格および最短の作業日数で受託構築します。必要に応じてプロジェクトごとに新規遺伝子合成やGolden Gateクローニングなど、他の様々な方法を使用しています。

プラスミドの複製起点が低コピーoriではないですか？

大腸菌の１細胞あたりのプラスミドコピー数は、プラスミドの複製起点によって決まります。複製起点によっては、性質上、低コピー数のタイプがあります。プラスミドの複製起点にどのoriが使われているか、低コピーoriかどうかを確認してください。低コピーoriをもつプラスミドの場合、十分なプラスミドDNA収量を得るためにはプラスミドDNA調製用の大腸菌培養量を増やしてください（例えば100mlを1Lにするなど）。

VectorBuilderで提供しているプラスミドの複製oriをチェックする

プラスミドDNA精製カラムに対して、容量以下の大腸菌カルチャーを使っている

プラスミドプレップカラムの結合容量と、プラスミドが高コピープラスミドか低コピープラスミドかを確認してください。ミニプレップの場合、1〜5mlのO/Nカルチャーをカラムに使ってください。マキシプレップの場合、高コピープラスミドの場合、100〜150mlのO/Nカルチャーを、低コピープラスミドの場合、300〜500mlのO/NカルチャーをプラスミドDNA精製に使用することをお勧めします。通常、高コピープラスミドの場合、ミニプレップでは培養液1mlごとに約5ugのプラスミドDNAを抽出でき、150mlの培養液から約500ugのプラスミドDNAを回収できます。低コピープラスミド（例：pET）の場合、ミニプレップで培養液1 mlごとに1.5〜2.5 ugのプラスミドDNA、培養液150 mlから150〜200ugのプラスミドDNAが回収できます。

選択薬剤が失活していて、プラスミドを持たない大腸菌がカルチャーの大部分を占めているのではないですか？

一部の抗生物質、特にアンピシリンは、液体培養で急速に失活します。その結果、プラスミドを持たない大腸菌がカルチャーの大部分を占め、全体としてのプラスミドの収量が低下している可能性があります。これを回避するために、液体培地のアンピシリンは使用直前に加えること、また新しく作成した液体培地を使う場合は、オートクレーブ後は十分に冷まして（少なくとも37度の培養温度）からアンピシリンなどの抗生物質を加えてください。また、アンピシリンなどの抗生物質のストック溶液もー20度で適切に保存されたものを使い、液体培養に適切な濃度で添加してください。アンピシリン耐性菌を培養する場合は、長時間の培養は避けてください。培養液中の抗生物質が失活してプラスミドを持たない大腸菌が増えてくることに加え、非常に長い培養後の大腸菌からプラスミドDNAを抽出すると、多くの大腸菌が死んでいるため、プラスミドDNAがすでに分解しています。適度な培養時間、温度、回転数で培養してください。O/N培養の目安は16時間以内です。もしプラスミド精製がすぐに開始できない場合、大腸菌カルチャーを遠心チューブに移してスピンダウンし、上清を捨て、ペレットにした状態で、-20°Cまたは-80°Cのフリーザーに保管し、後のプラスミドDNA精製に備えてください。

大腸菌グリセロールストックから直接液体培養を始めていませんか？

ベクタービルダーから納品された大腸菌のグリセロールストックまたはスタブから直接液体培養に持っていた場合、プラスミドDNAの収量が低くなる事例が報告されています。納品されたストックはまず適切な抗生物質を含んだLBプレートに線画培養し、O/Nで増殖した単一コロニーを複数ピックアップしてフレッシュな液体培養をスタートしてください。インストラクションは、リソース> ユーザーインストラクション > グリセロールストック　よりダウンロードしてください。

プラスミド精製キットのインストラクションに沿って操作していますか？

プラスミド精製キットを使っている場合、使用前にユーザーマニュアルを読み、プロトコールの各ステップの目的を理解してください。キットを正しく使用していない場合、プラスミド収量と精製度が下がる可能性があります。

ミニ/マキシプレップに使うカラムの品質が高くない

プラスミドプレップカラムのメーカーによっては、プラスミドDNAの精製度と収量にばらつきがあります。

当社のQC試験で同義変異（サイレント変異）が検出された場合、この変異が実験結果に影響する可能性は低いため、クローニングを進める上での承認を得るためにご連絡いたします。しかし、非同義変異（ミスセンス変異）が発見された場合は、クローニングやダウンストリームサービスを開始する前に、修正するための最善の方針についてご相談させていただきます。