CRISPR（クリスパー）ゲノム編集ソリューションズ

CRISPRシステムは、ますます多様な用途に利用されるようになってきており、各CRISPRアプローチには少なくともCasタンパク質とガイドRNA（gRNA）という2つの基本コンポーネントが必要です。最も一般的に使用されるCasエンドヌクレアーゼは、Streptococcus pyogenesに由来するもの（別名：SpCas9、またはヒト用にコドン最適化を施したhCas9）です。これはRNAガイド型のDNAヌクレアーゼであり、ターゲット部位で二本鎖切断（DSB）を引き起こします（図1）。Cas9は、gRNAによって宿主ゲノム内の標的部位に局在化され、gRNAがPAM（Protospacer Adjacent Motif）の直近の領域を相補的に認識するように設計されている場合にDSBを引き起こします。PAM配列は使用する特定のCas酵素によって異なり、SpCas9の場合、PAM配列はNGGまたはNAGです（図1のオレンジ色のDNA）。

図1.遺伝子ノックアウトまたは正確な配列置換を行うためのCRISPR誘導型DNA修復のメカニズム

CRISPRシステムによってDSBが生成されると、細胞は最も一般的に非相同末端結合（NHEJ）経路を活性化してDNA切断を修復します。この時に、多くの場合はランダムで小さな欠失、まれに挿入や塩基置換が生じます。これらの変異がタンパク質コーディング領域を破壊し（例：フレームシフトを引き起こす欠失）、機能的な遺伝子ノックアウトにつながります。デュアルgRNA はCas9と導入することで、2か所でDSBを引き起こし、2つのターゲット部位DNA断片を欠失させることができます（図2）。また、デュアルgRNAを使用して2つの異なる遺伝子を同時にターゲットとすることも可能です。

一方、ドナーDNAテンプレートが存在する場合、より低い効率ですがDSBは相同換え修復（HDR）経路を介し修復されることがあります。ドナーDNAがCRISPRコンポーネントと共に導入されると、HDRを経てターゲットゲノムDNA配列がドナー配列に置き換えられ、点変異やノックイン配列などを正確に導入することができます。ドナーDNAテンプレートは、一本鎖オリゴヌクレオチド（ssODN）または二本鎖DNA (dsDNA) 断片（標準プラスミドまたはAAVベクター由来の線状化DNA）を使用します。ssODNは点変異や小さなタグ挿入の導入に適している一方、dsDNA断片は外来遺伝子の安定組み込みのように大きな断片のノックインを導入するために広く使用されます。

もう一つ広く使用されているCas9バリアントであるCas9「ニッケース」（例：Cas9(D10A)）は、DNAに一本鎖切断を生成します。Cas9ニッケースが、単一の標的領域を挟む2つの反対鎖をターゲットとする2つのgRNAと組み合わせて使用​​される場合、ニッケースは各鎖に一か所ずつ、二か所の一本鎖切断を生成し、図2に示すように標的領域周辺に広範囲の二本鎖切断（DSB）を引き起こします。一本鎖ニックは非常に正確に修復されるため、両鎖にオフセットgRNAが正しく結合し、それぞれにずれた位置で一本鎖切断が生成された場合にのみ、効率的に二本鎖切断が生じます。したがって、この二重一本鎖切断戦略は、多くの遺伝子座で高いオンターゲット効率を維持しながら、オフターゲット活性を劇的に低減します。

図2. 2種類のgRNAを用いたニッケース活性

不活性型Cas9（dCas9）は、他の転写調節補助因子と組み合わせることで、CRISPRを介した内因性ゲノム遺伝子座の転写制御を行うことができます。CRISPRによる遺伝子制御は、クロマチン上の制御因子の検証、標的細胞のリプログラミング、または増殖と分化を促進する遺伝子を同定するための全ゲノムスクリーニングなど、幅広く応用できます。

遺伝子の転写を活性化（CRISPRa）するには、相乗的活性化因子（SAM：Synergistic Activation Mediator）システムを利用できます。このシステムは、dCas9/VP64融合タンパク質、MS2/P65/HSF1ヘルパー複合体、および改変型gRNA（msgRNA）の3つのコンポーネントを使用します。dCas9タンパク質は、合成転写活性化因子であるVP64と融合タンパク質を生成するように設計し、gRNAは、NF-kB（p65）およびHSF1の転写活性化ドメインからなるMS2複合体をリクルートするMS2アプタマーを含むようにします。図5に示すように、dCas9/VP64融合タンパク質とMS2/P65/HSF1複合体は相乗的に作用し、内因性の転写機構と補因子をリクルートして標的遺伝子の発現を活性化します。SAMシステムに加え、VectorBuilderはHSF1の転写活性化ドメインをEBウイルスRトランスアクチベーターに置き換えたdCas9/VP64-p65-Rta（VPR）システムも提供しています。dCas9/VPRシステムは、より高いレベルの内因性活性化を示すと報告されていますが、サイズが大きくなるため、AAVにはサイズが小さいdCas9/VP64が適しています。

一方、標的遺伝子の転写を抑制（CRISPRi）するためには、dCas9をKRAB（Kruppel-associated box domain）やMeCP2などの転写抑制因子と組み合わせるようにします。現在、2種類のdCas9/KRABヘルパーベクター：オリジナルのdCas9/KRABベクターと改良型のdCas9/KRAB/MeCP2が利用可能です。改良型は、二分割型リプレッサードメインKRAB/MeCP2と融合したdCas9発現を誘導し、DNA標的部位のより強力な転写抑制が達成されます。KRABドメインは、ヒトの転写因子に一般的に見られ、ヒトゲノムで現在同定されている最も強力な転写抑制因子の一つです。MeCP2は、ヒストン脱アセチル化酵素を動員することでKRABによる抑制をさらに強化し、クロマチン凝縮とエピジェネティクス修飾による抑制をもたらします。図6に示すように、gRNAがdCas9/KRAB/MeCP2を内因性プロモーターにリクルートするように設計されている場合、転写は強力に抑制されます。

CRISPRを用いたゲノム編集や制御には、標的細胞内でCas9と標的部位特異的なgRNAが共発現する必要があります。どのような手法を取るとしても、CRISPRコンポーネントを標的細胞に導入しなければなりません。特異的コンポーネントは、以下の手法でトランスフェクションまたは遺伝子導入ができます。

• gRNAおよびCas9プラスミド
• gRNAおよびCas9ウイルス（レンチウイルス、AAV、アデノウイルスなど）
• gRNAおよびCas9 mRNAの混合物
• gRNAとCas9タンパク質からなるRNP複合体

図3は、様々なCRISPRの導入方法をまとめた図です。図7、8、9、および10のケーススタディでは、それぞれの導入方法の有効性を示しています。

図3.CRISPRコンポーネントを標的細胞に導入するための一般的な手法

各導入方法の主なメリットとデメリットを以下の表にまとめました。実験内容に最も適した手法を選択する際の参考としてご利用ください。

VectorBuilderのオンラインCRISPRベクターデザインツールは、ヒト、マウス、およびラットに対応する最適化された全ゲノムgRNAデータベースを備えており、高いターゲティング効率を持つCRISPRベクターの設計を可能にします。また、より多くのCas酵素とより多くの宿主種を含むようにgRNAデータベースを拡張中です。CRISPRライブラリーデザイン（CLD）で利用されているアルゴリズムに従って、gRNAの特異性スコアを算出しています。具体的には、ある種でN(20)NGG配列を標的とするgRNAに対し、ゲノム内の標的配列とのミスマッチが3塩基以下となる潜在的なオフターゲット部位をすべて検索します。この方法で特定された各潜在オフターゲット部位について、単一のオフターゲットスコアを算出します。その後、すべてのオフターゲット部位のスコアが集計し、gRNAの最終的な特異性スコア（0から100の間）を計算します。スコア（値）が高いほど標的特異性が高いことを示します。特異性スコアは、あくまでも理論的な指標であることをご留意ください。実際のターゲティング効率と特異性は、スコアの予測と異なる場合があります。スコアが低いgRNAでもうまく機能する可能性があります。

VectorBuilderのオンラインプラットフォームでCRISPRベクターを設計する際、当社のデータベースで標的遺伝子を検索できるようになっています。遺伝子名を入力すると、データベースでターゲット遺伝子に対して利用可能なgRNA一覧が表示され、詳細情報を閲覧できます。

図4.  gRNA-Cas9リボ核タンパク質 (RNP)およびデュアルgRNA法を用いたDNA断片欠失によるホモ接合型ノックアウト (KO) 変異体の作製。 (A)標的遺伝子から13 kbの領域を欠失させるように2か所を標的としたRNPを標的細胞にエレクトロポレーションし、単一クローンを分離してスクリーニングを行った。モノクローン細胞候補の遺伝子型をPCRとサンガーシーケンシングで検証した。(B) 4つのプライマー（P1からP4）を3種類の組み合わせでPCRに使用し、KOクローンとWTクローンを選別した。クローン1はホモ接合型KO変異体であることが、(C) PCRの結果と (D) シーケンシングの結果によって確認された。

図5. レンチウイルスを用いたCRISPRaによる遺伝子発現の活性化。 SAM複合体dCas9/VP64およびMS2/P65/HSF1を安定発現するNIH3T3細胞に、msgRNA発現レンチウイルスを感染させ、抗生物質選択を行った。(A) 転写活性化制御の模式図。(B) マウスBrn2遺伝子のプロモーター領域を標的とするmsgRNAnのデザイン図。(C) スクラ ンブルまたはターゲティングmsgRNAを導入したNIH3T3細胞、または無処理コントロール（NC）細胞におけるBrn2の相対的な遺伝子発現をqRT-PCR法にて測定した結果（平均±SD、*P<0.05、Tukey法によるANOVA）。

図6. レンチウイルスを用いたCRISPRiによる遺伝子発現の抑制。 dCas9/KRAB/MeCP2転写抑制複合体を安定発現するJurkat細胞に、gRNA発現レンチウイルスを感染させ、抗生物質選択を行った。(A) dCas9/KRAB/MeCP2複合体によ転写抑制制御の模式図。(B) ヒトCXCR4遺伝子のプロモーター領域を標的とするgRNAデザイン図。(C) スクランブルまたはターゲティングgRNA導入したJurkat細胞、または無処理コントロール（NC）細胞におけるCXCR4タンパク質発現レベルをウェスタンブロットで検出した。(D) qRT-PCR法で定量したCXCR4遺伝子の相対的な発現量（平均±SD、***P<0.001、****P<0.0001、Tukey法によるANOVA）。(E) 細胞表面に発現しているCXCR4をフローサイトメトリーで定量した。CXCR4はモノクローナル一次抗体と蛍光標識二次抗体で染色した。未標識および二次抗体のみを使用したJurkat細胞をネガティブコントロールとして使用した。(F) CXCR4ターゲティングgRNAを導入した細胞の表面CXCR4量は、スクランブルgRNAを導入した細胞と比較して約50%減少した（平均±SD）。

CRISPRコンポーネントを標的細胞に導入するには、いくつかの方法があり、それぞれに独自の利点や制限があります。

1. gRNAとCas9プラスミド
2. gRNAとCas9ウイルス
3. gRNAとCas9 mRNAの混合物
4. gRNAとCas9タンパク質（RNP複合体）