MMLVレトロウイルスNon-Coding RNA発現ベクター

概要

MMLVレトロウイルスnon-coding RNA発現ベクターは哺乳類動物細胞において恒久的にnon-coding RNA発現させることができます。Non-coding RNAは多種のshort(30塩基以下)もしくはlong(200塩基以上)機能性RNA分子を含みます。micro RNAs (miRNAs)、small interfering RNAs (siRNAs)、piwi-interacting RNAs (piRNAs)、small nuclear RNAs (snRNAs)、small nucleolar RNAs (snoRNAs)、large intergenic non-coding RNAs (lincRNAs)、intronic long non-coding RNAs (intronic lncRNAs)、natural antisense transcripts (NATs)、enhancer RNAs (eRNAs) 、 promoter-associated RNAs (PARs)などの機能性RNAがあります。これらはタンパク質に翻訳されることはありませんが、DNA複製、エピジェネティック制御、転写および転写後制御そして翻訳制御など数多くの細胞内機構で重要な役割を担っています。

MMLVレトロウイルスnon-coding RNA発現ベクターはMMLVレトロウイルスゲノムの5’LTR(long terminal repeat)がもつ遍在的プロモーター活性(RNAポリメラーゼⅡを用いる)を利用してnon-coding RNAを発現します。RNAポリメラーゼⅡプロモーターによる転写反応はプロモーターの3‘域から始まり、ポリAシグナル配列内で終了します。そのため、当ベクターから生産されるnon-coding RNAとオリジナルのnon-coding RNAの配列は正確に一致せず、上流と下流にいくつかの配列が追加されます。

MMLVレトロウイルスnon-coding RNA発現ベクターはE.coliプラスミドとして作製されます。non-coding RNAは2つのLTRのあいだにクローニングされます。non-coding RNA発現ベクターはヘルパープラスミドとともにパッケージング細胞に導入されます。ベクターのLTRのあいだの領域がRNAに転写され、ヘルパープラスミドから発現するウイルスタンパク質によってRNAはウイルスにパッケージングされます。こうして作られたウイルスは上清に放出され、直接もしくは濃縮した後に標的細胞への感染に用いられます。

ウイルスが標的細胞に感染すると、RNAゲノムが細胞内に注入されてDNAに逆転写後に宿主ゲノムへ挿入されます。こうしてLTRのあいだにあるnon-coding RNAは宿主ゲノムへ挿入され、恒久的に維持されます。

MMLVウイルスベクターはウイルスのパッケージングや感染に必要になる遺伝子群が取り除かれています。これらの遺伝子はヘルパープラスミドから提供されます。その為、当社のベクターから生産されるウイルスは複製不能(細胞に感染はできるが複製はできない)なので安全です。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Cell. 157:77 (2014) Review on non-coding RNAs
Front Genet. 6:2 (2015) Review on functionality of non-coding RNAs
PLoS One. 8:e77070 (2013) Retrovirus-mediated expression of long non-coding RNA
Exp Hematol. 31:1007 (2003) Review on retrovirus-mediated gene expression
J Virol. 61:1639 (1987) Extended packaging signal increases the titer of MMLV vectors
Gene Ther. 7:1063 (2000) Tropism of MMLV vectors depends on packaging cell lines
Nat Protoc. 6:346 (2011) Tropism of MMLV vectors depends on packaging plasmids

特徴

MMLVレトロウイルスnon-coding RNA発現ベクターはE.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範囲な細胞タイプへの高効率なウイルスの感染、宿主ゲノムへの遺伝子挿入および高レベルの発現を実現できます。

メリット

ベクターの恒久的な挿入: 従来の方法で宿主細胞へ導入された遺伝子は時間経過とともに失われてしまいます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。一方でMMLVウイルスベクターを用いればnon-coding RNAを恒久的に宿主ゲノムへ挿入できます。

非常に幅広い親和性:当社のウイルスパッケージングシステムはVSV-Gエンベロープタンパク質をウイルス表面に追加してあるので幅広い親和性を実現しています。そのため一般的な哺乳類動物細胞(ヒト、マウス、ラットなど)への遺伝子導入が可能です。さらに、ほとんどの哺乳類細胞タイプに遺伝子を導入することも可能ですが、非増殖細胞に対しては問題があります。

組み込み可能サイズ:野生株MMLVレトロウイルスゲノムはおよそ8kbです。当社のベクターのウイルスパッケージングと感染に必要となるコンポーネントはおよそ2.5kbとなるので5.5kbを上限として実験に必要なDNA配列を組み込むことができます。当ベクターのnon-coding RNA挿入用途には十分なサイズが確保されています。

高レベル発現:5' LTRのプロモーター活性は強力であり、non-coding RNAを高レベル発現します。

導入コピー数にばらつきが少ない:従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法は導入ベクターコピー数が細胞ごとに大きなばらつきが生じますが、一般的にウイルスによる遺伝子導入は導入ベクターコピー数が比較的に均一になります。

In vitroとin vivoで有効:MMLVレトロウイルスベクターは培養細胞と生体の両方に対して効果的です。

安全性:ウイルスのパッケージングと感染に必要な遺伝子群がヘルパープラスミドに移されていることにより複製可能なウイルスが発生する可能性はないので、当ベクターの安全性は保証されています。

デメリット

5' LTRプロモーター以外の選択肢がない: 当ベクターからのnon-coding RNAの発現は5' LTRのプロモーター活性によって行われます。当社のレンチウイルスベクターが任意のプロモーターを選択できることと比較して明確な短所になります。

中程度のウイルスタイター: 当ベクターからパッケージング細胞の上清からおよそ~108 TU/mlのタイターが得られます。レンチウイルスベクターと比較すると一桁低いタイターになります。

非増殖細胞へは使えない:当ベクターの非増殖細胞への使用は推奨されません。

技術的な複雑さ:当ベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

基本コンポーネント

5' MMLV LTR : MMLVレトロウイルス5' long terminal repeat。野生株のMMVLウイルスの5' LTR と3' LTRの配列は相同。5‘LTRと3‘LTRはウイルスゲノムの両端に同じ向きで配置される。ウイルスゲノムの挿入過程に3‘LTRの配列は5‘LTRに上書きされる。LTRはプロモーターとポリアデニレーションシグナルの両方の機能があり、野生株では5‘LTRはウイルスゲノムを転写するプロモーターとして、3‘LTRは転写終了させるためのポリアデニレーションシグナルとして機能する。

Ψ plus pack2: MMLVレトロウイルスRNAのパッケージングに必要なシグナル。

Non-coding RNA: 実験に使用するnon-coding RNA。5' LTRのプロモーター活性によって転写される。

3' MMLV LTR: MMLVレトロウイルス3' long terminal repeat。 ポリアデニレーションシグナルとして機能して、上流のnon-coding RNA転写を停止する。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。