自己相補型アデノ随伴ウィルス発現ベクター(scAAV)
アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus :AAV)発現ベクターはin vitro及びin vivoでの遺伝子導入に広く用いられています。AAVは多くの哺乳類細胞株への遺伝子導入が可能であり、アデノウィルスと異なり免疫原性が非常に低いため、モデル動物を使ったin vivo研究には病理的影響を殆ど考えずに使用できます。
scAAVベクターは、まず大腸菌用のプラスミドDNAとして構築されます。このベクターには、5'側inverted terminal repeat (ITR)と3’側ITRに挟まれた配列に目的遺伝子をクローニングします。精製したこのプラスミドベクター(トランスファーベクター)は、ヘルパープラスミドと共に、ウイルス産生細胞(当社ではHEK293T細胞を使用)にトランスフェクトします。ヘルパープラスミドは、トランスファーベクターの、5'側inverted terminal repeat (ITR)と3’側ITRに挟まれた配列をウィルス粒子内にパッケージングする手助けをします。このようにして作製されたAAVベクターをターゲット細胞に感染させることで、目的遺伝子を形質導入します。
野生型のAAVゲノムは1本鎖線状DNA(single strand linear DNA)で両末端にヘアピン構造をとったITRsを保有しています。そのため、ssAAVと呼ばれますが、ssAAVの遺伝子を宿主細胞内で発現させるためにはまず1本鎖DNA(ssDNA)を2本鎖DNA (dsDNA) に変換する必要があります。それには (1) 宿主細胞のDNAポリメラーゼを活用し、ssDNAの3’側のITRを複製起点として相補鎖を合成する、(2) ssAAVゲノムのプラス鎖とマイナス鎖を合成しする、二通りの方法があり、(1)がよく使用されています。
当社のscAAVベクターは、ssAAVに比較して、主に以下の2つの点で異なります。まず、3’末端のITRからtrs (terminal resolution site) を欠失させ、複製時にプラス鎖とマイナス鎖のDNAをそれぞれ1本鎖として合成するようになっています。そしてその相補鎖は分子間相互作用によって2本鎖DNAを形成することが可能です。そのため、scAAVを宿主細胞に感染させると相補的なDNA鎖を合成するステップを経ることなく、目的遺伝子を発現させることができます。ssAAVの導入効率を左右する主な理由は、導入先で相補鎖の合成過程を成功にかかっていたため、scAAVはssAAVに比べて、目的遺伝子をより早く、かつ高効率に発現させることが可能になりました。次に野生型のAAVでは4.7kbまでの長さの1本鎖DNAを包括することができますが、scAAVでは2つの相補鎖をコンカテマーとしてパッケージングするため、5' ITR から 3' ITR間に挿入できる遺伝子配列の長さはssAAVの約半分になってしまいます。ssAAVに比べて、さらに導入できる遺伝子サイズに制限があります。
AAVの最も大きな利点はバイオセーフティレベル1(BSL1)の実験室で扱えることです。これはAAVは、宿主細胞内で複製できないようにエンジニアリングされているため、ウイルスを扱うヒトにもし感染したとしても、めったに炎症が起こらないとされています。
AAVは多くの系統が同定されており、ウィルスの表面タンパク質(カプシドタンパク質)の抗原性の違い(血清型またはセロタイプ)により型が分類されています。血清型の違いにより、組織指向性(組織別感染効率)が異なります。AAVベクターをウィルス粒子にパッケージングする際はその組織指向性を考慮して使用するウィルスの血清型を選ぶ必要があります。現在、当社で提供しているセロタイプは、 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6.2, 7, 8, 9, rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro そして AAV2-QuadYFです。以下にAAVのセロタイプと組織指向性の対応表を示します。
セロタイプ |
組織指向性 |
AAV1 |
Smooth muscle, skeletal muscle, CNS, brain, lung, retina, inner ear, pancreas, heart, liver |
AAV2 |
Smooth muscle, CNS, brain, liver, pancreas, kidney, retina, inner ear, testes |
AAV3 |
Smooth muscle, liver, lung |
AAV4 |
CNS, retina, lung, kidney, heart |
AAV5 |
Smooth muscle, CNS, brain, lung, retina, heart |
AAV6 |
Smooth muscle, heart, lung, pancreas, adipose, liver |
AAV6.2 |
Lung, liver, inner ear |
AAV7 |
Smooth muscle, retina, CNS, brain, liver |
AAV8 |
Smooth muscle, CNS, brain, retina, inner ear, liver, pancreas, heart, kidney, adipose |
AAV9 |
Smooth muscle, skeletal muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, inner ear, testes, kidney, adipose |
AAVrh10 |
Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney |
AAV-DJ |
Liver, heart, kidney, spleen |
AAV-DJ/8 |
Liver, brain, spleen, kidney |
AAV-PHP.eB |
CNS |
AAV-PHP.S |
PNS |
AAV2-retro |
Spinal nerves |
AAV2-QuadYF |
Endothelial cell, retina |
AAV2.7m8 |
Retina, inner ear |
組織 |
推奨されるAAVセロタイプ |
Smooth muscle |
AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
Skeletal muscle |
AAV1, AAV9 |
CNS |
AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-PHP.eB |
PNS |
AAV-PHP.S |
Brain |
AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8 |
Retina |
AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8 |
Inner ear |
AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8 |
Lung |
AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAVrh10 |
Liver |
AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
Pancreas |
AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
Heart |
AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ |
Kidney |
AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
Adipose |
AAV6, AAV8, AAV9 |
Testes |
AAV2, AAV9 |
Spleen |
AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
Spinal nerves |
AAV2-retro |
Endothelial cells |
AAV2-QuadYF |
本ベクターシステムの詳細については、下記の文献をご参照ください。