自己不活性型MMLVレトロウイルスNon-Coding RNA発現ベクター

概要

MMLVレトロウイルスベクターシステムは、ノンコーディングRNAを哺乳類細胞に恒久的に導入するために効率的なベクターです。ノンコーディングRNAには、マイクロRNA（micro RNAs; miRNA）、低分子干渉RNA（small interfering RNAs; siRNA）、piwi-interacting RNA（piRNA）、低分子核内RNA（small nuclear RNAs; snRNAs）、低分子核小体RNA（small nucleolar RNAs; snoRNA）、大遺伝子間非コードRNA（large intergenic non-coding RNAs; lincRNA）、イントロン長鎖非コードRNA（intronic long non-coding RNAs; lncRNA）、天然アンチセンス転写産物（natural antisense transcripts; NAT）、エンハンサーRNA（enhancer RNAs; eRNA）、プロモーター関連RNA（promoter-associated RNAs; PAR）など、短い（30塩基未満）ものから長い（200塩基以上）ものまで、多種多様な機能性RNA分子が含まれています。これらは、いずれもタンパク質には翻訳されませんが、DNA複製、エピジェネティック制御、転写・転写後制御、翻訳制御など、多くの細胞内プロセスにおいて重要な役割を果たしていることが明らかになっています。

MMLVはモロニーマウス白血病ウイルスに由来するレトロウイルスベクターで、効率的にゲノムインテグレーションを実現するプラス鎖直鎖RNAウイルスです。野生型MMLVレトロウイルス遺伝子発現ベクターでは5' long terminal repeat (LTR) 内にあるユビキタスな発現を誘導するプロモーターを利用して目的遺伝子を発現させますが、自己不活化型MMLVレトロウイルス遺伝子発現ベクターでは目的遺伝子を発現誘導するプロモーターはユーザーが選択できます。これはMMLV 3’LTRのU3領域を欠失させると5' LTRにあるプロモーターが不活化する（自己不活性化）ことを利用しています。この仕組みは目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの選択の幅を広げるだけでなく、ベクターインテグレーション（ゲノムへの挿入）による近傍遺伝子への影響により心配されるガン化リスクを軽減させ、野生型MMLVベクターよりもさらに安全性を高められます。

自己不活性化型MMLVレトロウイルスベクターは、まず大腸菌でプラスミドとして構築されます。その後、いくつかのヘルパープラスミドとともにパッケージング細胞にトランスフェクトします。パッケージング細胞内では、LTR間に位置するベクターDNAがRNAに転写され、ヘルパープラスミドによって発現されたウイルスタンパク質によってRNAがウイルスにパッケージングされます。生ウイルスは培養上清に放出され、この上清液を直接あるいは濃縮後、ターゲット細胞の感染に使用します。

ウイルスを標的細胞に加えると、RNAカーゴは細胞内に移動し、そこでDNAに逆転写され、宿主ゲノムにランダムに組み込まれます。ベクター構築時に2つのLTRの間に配置されたノンコーディングRNA配列は、残りのウイルスゲノムとともに宿主DNAに恒久的に挿入されます。

自己不活性型MMLVレトロウイルスベクターはウイルスパッケージングと遺伝子導入に必要な遺伝子を欠損し、代わりにこれら遺伝子はウイルスパッケージングに使用されるヘルパープラスミド（またはパッケージング細胞）に組み込まれています。このため、生成されるウイルスは、細胞に導入されても複製はされず、安全に配慮されたシステムとなっています。

本ベクターシステムの詳細については、以下の文献をご参照下さい。

参考論文	トピックス
Cell. 157:77 (2014)	Review on non-coding RNAs
Front Genet. 6:2 (2015)	Review on functionality of non-coding RNAs
PLoS One. 8:e77070 (2013)	Retrovirus-mediated expression of long non-coding RNA
J Virol. 61:1639 (1987)	Extended packaging signal increases the titer of MMLV vectors
Gene Ther. 7:1063 (2000)	Tropism of MMLV vectors depends on packaging cell lines
Proc Natl Acad Sci USA. 83:3194 (1986)	Designing of self-inactivating retroviral vectors for gene transfer into mammalian cells

特長

自己不活化型（SIN）MMLVレトロウイルスノンコーディングRNA発現ベクターは、大腸菌での高コピー数複製、生ウイルスの高力価パッケージング、幅広い細胞への効率的なウイルス導入、宿主ゲノムへの効率的なベクターインテグレーション、および高レベル発現のために最適化されています。

メリット

ベクターDNAの恒久的な組み込み: 一般的なトランスフェクションでは、ベクタープラスミドは時間の経過と共に失われるため、DNAの導入は一過性で、分裂速度の早い細胞においては特に不安定となります。しかしながら、レトロウイルスでは、宿主ゲノムへ組み込まれるため、恒久的に遺伝子を導入することができます。

広範な組織指向性: 当社のパッケージングシステムではウイルス表面にVSV-Gエンベロープタンパク質を発現させています。VSV-Gエンベロープタンパク質は幅広い指向性を持つため、非分裂細胞を除き、一般的によく用いられる生物種（哺乳動物以外のいくつかの生物種においても）由来の細胞に効率よく導入することができます。

プロモーターを選択可能: 5’LTRのプロモーターはゲノム挿入時に自己不活化するようにデザインされているため、ノンコーディングRNAを駆動するプロモーターをユーザーが選択することができます。野生型MMLVレトロウイルスベクターでは、5’LTRのプロモーターによってユビキタスに発現させることしかできないため、大きな利点となります。

遺伝子導入の均一性が高い: 一般的に、ウイルスによる導入は比較的バラツキが少なく、細胞間で均一にベクターを導入することができます。反対に、一般的なトランスフェクション法では、ある細胞では高コピー数、またある細胞では低コピー数あるいは全く導入されないなど、プラスミドベクターの導入は非常に不均一になります。

In vitroとin vivoでの使用: 主にin vitroで培養細胞の導入に使用されますが、生きた動物の細胞へ導入する場合にも使用することができます。

安全への配慮: 本ベクターの安全性は2つの特徴によって保証されています。まず、ウイルスパッケージングと導入に必須な遺伝子を複数のヘルパープラスミドに分散し、安全性を高めています。また、ゲノムに挿入される際に5' LTRのプロモーター活性が自己不活化するため、パッケージングとトランスダクションの間に複製能を持つウイルスが出現することは本質的に不可能です。

デメリット

中程度のウイルス力価: パッケージング細胞上清から得られるウイルス力価は、濃縮をしない場合～10⁷ TU/mlで、レンチウイルスよりも1桁程度低くなります。

野生型MMLVよりも限られたカーゴスペース: MMLVレトロウイルスのゲノムは約8.3 kbです。当社のベクターでは、ウイルスのパッケージングとトランスダクションに必要なコンポーネントが2.6-3 kbを占めており、ノンコードRNAとプロモーターを含むユーザーの目的のDNAを収容できるサイズは5.3-5.7 kbまでと制限されます。

非分裂細胞への導入が困難: 非分裂細胞への導入は困難です。

技術的な難しさ: MMLVウイルスベクターを形質導入に使う前に、ウイルス産生細胞に複数のプラスミドDNAをトランスフェクトして、生きたウイルス粒子を作成させ、精製し、ウイルスのタイターを測定するなど、形質導入までにこなさなければならない様々な作業があります。これらの作業は、一般的なプラスミドのトランスフェクション法に比べ、技術的に習熟するまでの期間や、さらに実際のウイルス作製日数も長くかかります。

基本コンポーネント

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. パッケージング細胞でウイルスRNAの転写を促進し、転写されたRNAはウイルス粒子にパッケージングされます。

MMLV 5' LTR-ΔU3: 欠損型 MMLVレトロウイルス5' long terminal repeat. 野生型MMLVレトロウイルスでは 5' LTR と3' LTR は全く同じ配列です。ウイルスゲノムの両末端に位置し、配列の向きが内側に同じになるようになっています。ウイルスがゲノムに挿入される際に3' LTR 配列は5' LTRにコピーされます。 LTRsは両方ともプロモーターとポリアデニル化の機能を持っており、5’LTRは転写を促進するプロモーターの役割をし、3’LTRは転写を終結させるためにポリアデニル化を誘導します。本ベクターではMMLV 5' LTR-ΔU3 はLTRのプロモーター活性に必要な領域を欠失させてあります。Δ5' LTRの上流にCMVプロモーターが組み込まれているため、この欠失によりウイルスRNAのパッケージングに影響が出ることはありません。

Ψ plus pack2: MMLVレトロウイルスRNAのパッケージングに必要なシグナル。

Promoter: ここに目的遺伝子を発現させるプロモーターを配置します。

Non-coding RNA: 実験に使用するnon-coding RNA。

WPRE: Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element. パッケージング細胞内でのウイルスRNAの安定性を高め、ウイルス粒子にパッケージングされるタイターを向上させます。

MMLV 3' LTR-ΔU3: U3欠損型MMLVレトロウイルスの3’long terminal repeat (LTR) です。この変異型3’LTRは、ウイルスベクターが宿主ゲノムにインテグレーションされる際に5’LTRが3’LTRからコピーされるため、5’LTRのプロモーターは活性を失います。 MMLV 3' LTR-ΔU3 のポリＡ付加シグナルは、上流ORFの転写を終結させます。

SV40 late pA: シアミンウイルス40 （Simian virus 40）後期ポリA付加シグナル。3’LTRの下流でORFの転写終結するために重要で、ウィルスタイターを向上させます。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。