shRNAライブラリー構築サービス
ベクタービルダーは、高品質なプール型カスタムRNAiノックダウンライブラリーを構築し、大規模な機能喪失スクリーニングのための強力で費用対効果の高いソリューションを提供します。shRNAライブラリーは、大腸菌グリセロールストック、プラスミドDNA、または組換えウイルスとして納品することができます。次世代シークエンシング（NGS）によるカスタムライブラリーの徹底的な検証を行い、納品時にライブラリーの品質に関する正確な情報を提供します。
特長
- 幅広い複雑性: 数百から最大106までの多様なshRNAライブラリーを構築可能。
- 無制限にカスタマイズ可能なベクターデザイン: デリバリー方法、プロモーター、マーカー、バーコードなど、要望に応じてベクターデザインを完全にカスタマイズすることが可能。
- 高品質ウイルスパッケージング: 迅速な納期と手頃な価格で様々なウイルスシステムへのパッケージング。
- 高いカバレッジと均一性: 弊社のライブラリーは設計されたshRNAの98%以上のカバレッジを達成可能。
サービス詳細
価格と作業日数 プライスマッチ
表1. 各サービスの価格と作業日数
| サービス | 概要 | 価格 (税別、送料別) | 作業日数 |
|---|---|---|---|
| ライブラリーの設計 | shRNAノックダウンスクリーニングのためのライブラリーベクター設計、およびターゲット遺伝子のgRNA配列設計 | 無料 | 1-4日 |
| プール型ライブラリーのクローニング（オリゴ合成とNGS検証を含む） | shRNAオリゴ合成、ライブラリーベクターへのshRNAの大量並列クローニング、サンガーシーケンスによる予備検証、NGSによる完全検証を含む。納品物は大腸菌グリセロールストック中のライブラリーとNGSレポートが含まれる。詳細は下記表2を参照 | ||
| プール型ライブラリーのウイルスパッケージング | ウイルスパッケージングサービスの詳細はこちらをご覧ください。ライブラリープラスミドのパッケージング価格は、通常のベクタープラスミドのパッケージング価格の1.5倍となります。 | ||
| スクリーニングサンプルのNGSデコンボリューション | スクリーニングから得られた細胞のゲノムDNAからのNGSライブラリーの作成、Illuminaシークエンス(500x以上のカバレッジ)およびデータ解析を含む。 |
サンプル当たり65,100円から |
3-5週 |
表2. ライブラリーの複雑性に応じたクローニング価格対応表
| ライブラリーの複雑性 | 価格 (税別、送料別) | 作業日数 |
|---|---|---|
| <5x103 | 434,000円から | 5-8週 |
| 5x103 ~ 1x104 | 775,000円から | |
| 1x104 ~ 5x104 | 930,500円から | 6-10週 |
| 5x104 ~ 1x105 | 1,240,000円から | |
| >105 | お問い合わせください | |
技術情報
プールされたshRNAライブラリーによる遺伝子スクリーニングのワークフロー
プール型shRNAレンチウイルスライブラリーを用いた標準的な遺伝学的スクリーニングのワークフローを 下の 図 １ に示します。まず第一に、shRNAレンチウイルスライブラリーを細胞に感染させます。レンチウイルスが感染した細胞を陽性マーカー(例：薬剤耐性遺伝子または蛍光タンパク質)によって選択します。次に、陽性細胞をコントロール(reference population)と実験集団(experimental population)に分け、実験集団に対して特定の選択圧を加え(例：薬剤処理や継代）、目的の表現型を持つ細胞を選定します。スクリーニングとしては3種類のポピュラーな方法があります: １)生存スクリーニング。スクリーニングに使用した薬剤などの選択圧に耐性を持つ遺伝子を探索する；２）レポーターアッセイ。shRNAの発現によってレポーターの発現の増減を指標にして目的のshRNAを探索する；３）行動スクリーニング。細胞の浸潤、転移などに関わる遺伝子を同定する。スクリーニング後に実験集団の細胞とコントロールの細胞をそれぞれ回収し、サンガーシークエンシングまたは次世代シークエンシングによって、コントロールに対して濃縮もしくは枯渇したshRNAを同定して候補遺伝子を選び出します。このようにスクリーニングされた候補遺伝子群に対しては、さらなる機能解析を行います。
図1. プール型shRNAレンチウイルスライブラリーを用いた機能喪失スクリーニングのワークフロー。Acta Biochim Biophys Sin 44:103-112 (2012).
実験データ
図2. ヒトとマウスのエリート遺伝子（PubMed Centralで最も頻繁に引用される遺伝子〜2,000）とプール型ホールゲノムライブラリーにおけるshRNAの分布。shRNAリードカウントはNGSライブラリーサイズ（1,000万リード）で正規化し、log2スケールでプロット。
注文方法
お客様提供のプラスミドライブラリー
お客様によって作製されたライブラリーDNAを使用する場合は、マテリアル提出ガイドラインにしたがってライブラリーDNAを郵送してください。作業遅延やライブラリーのダメージを避けるために、当社のガイドラインに忠実に従った梱包をお願いいたします。お客様から提供されたすべてのマテリアルは、必ずベクタービルダーによる品質検査を受ける必要があり、マテリアル当たり16,000円の検査費用が発生します。マテリアルが品質検査を通過しないとライブラリー構築が開始できないことをご承知おきください。お客様によって作製されたプラスミドライブラリーからライブラリー構築をする場合、当社で最終的なライブラリーの複雑性と均一性の保証はいたしかねます。
リソース
FAQ
| アレイ型スクリーニング | プール型RNAiスクリーニング | |
|---|---|---|
| shRNAはどのように細胞へ導入されるのか？ | 個々のshRNAを、個々のマルチウエルプレートで培養された細胞に投与する(例：96穴または384穴)。 | 数百～数千種の異なるshRNAを、細胞集団に同時に投与する。 |
| 目的の表現型に関連するshRNAをどのように同定する？ | ウェルごとに表現型を調べることによって目的の表現型を示すウェルを同定する。個々のウェルに適用されたshRNA配列は既知となる。 | 目的の表現型を持つ細胞を集団から選択し、目的の細胞で濃縮／枯渇したshRNAをNGSにより同定する。 |
| 遺伝子相互作用のスクリーニングは可能か？ | 各ウェルに 1 つの shRNA を加える場合は不可能、各ウェルに複数の shRNA を加える場合は可能。 | 細胞にランダムに組み合わされた複数のshRNAを持たせることが可能。 |
| 技術的習熟度の違いによるデータのばらつき | 高い | 低い |
| 試料コストと労働コスト | 高い | 低い |
| 特別な装置の必要性 | 高い(例：リキッドハンドラー、ハイスループット画像処理設備など) | 低い(ラボベンチ上の標準機器) |
ベクタービルダーでは、RNAiコンソーシウム (TRC) のルールに近い方法に独自の改変を加えてshRNAをデザインし、shRNAのノックダウンスコアを算出しています。同定されている RefSeq転写産物に対して、ターゲットサイトの候補となる全ての21merシークエンスを検索します。次の特徴を持つ配列はｓｈRNA候補から除外されます： ノックダウンの効率/特異性を低下させると知られている特長を持ったシークエンス、クローニング作業に複雑度を増すシークエンス、さらに同一塩基が≥4連続、GまたはCが≥7連続する場合、GC 含量が25%以下または 60%以上の場合、さらに AAが5’ 末端にある場合などです。以下の様な場合、ノックダウンスコアー値にはペナルティーがつきます：内部にステムループ構造を持つ、3’末端に向かって高いGC含量を持つ、既知のmiRNAシードシークエンスの場合、または他の遺伝子がオフターゲットとしてマッチする場合です。1遺伝子から複数の転写産物が合成される場合、全ての転写産物をターゲットするシークエンスは高いターゲットスコアーが与えられます。 全てのスコアは ≥0以上で、中間値が ~5。標準偏差が~5。95%のスコアは ≤15以下となります。ノックダウンスコアが15に近いshRNAは、ベストなノックダウンパフォーマンスでクローニングも容易であると判断されます。対して、ノックダウンスコアが0のshRNAの場合、ノックダウンパフォーマンスも貧弱で、クローニングも困難であると判断されます。 ただし、特異性スコアはshRNAの特異性の大まかな指標として用いるようにしてください。実際の研究場面ではshRNAの特異性スコアが低くても、実験では十分に使えるgRNAがある例もあり、また、ノックダウンスコアが高いものの実際のパフォーマンスが貧弱な例も知られています。そして3’ UTR領域をターゲットとして選択することは、コーディンクシークエンスをターゲットするのと同様に効果的であることを念頭に置いてください。