変異ライブラリー構築サービス

技術情報

変異ライブラリー構築ストラテジー

チップによるオリゴ合成

チップによるオリゴ合成は、任意の部位に対して飽和変異を加える様な、様々なサイズと配列で予めデザインされた配列変異バリアントの合成に理想的です。当社のチップDNA合成は、低エラー率で通常300 ntまで行えます。

Error-prone PCR

Error-prone PCRは、元配列を変異させるためにPCR条件を変更することによって、非常に可変性の高い変異ライブラリーを作成するために最も簡単なアプローチです。具体的には、低フィデリティーポリメラーゼ、長い伸長時間、高いMg²⁺濃度、Mn²⁺の添加、異なるdNTP濃度を含む様々な最適でないPCR条件を組み合わせることで、オリジナルの配列にランダムな点変異を導入します。

縮重コドン

遺伝暗号の縮重は、1つのアミノ酸を複数のコドンでコードします。オリゴヌクレオチド合成における縮重コドンは、高度に制御されたランダム変異導入を可能にします。有意な結果が見込める標的領域やアミノ酸に的を絞った変異導入を可能にします。NNKライブラリーはポピュラーな縮重変異ライブラリーであり、20のアミノ酸すべてと1つの停止コドンをコードする32のNNK縮重コドンの組み合わせ（N= A/C/G/T、K= G/T）を使用します。ライブラリー構築に縮重コドンを利用することで、効果的にアミノ酸バリエーションを作り出すことが出来ます。

DNAシャッフリング

DNAシャッフリングは、相同組換えによって非常に効率的にキメラDNA配列を生成することが出来ます。親DNA配列を分解してランダムな断片にした後、プライマーレスPCRを用いて新しい変異キメラ配列に再構成します。DNAシャッフリングを用いた高複雑性ライブラリーは、配列の合理的な設計と定向進化に使用することもできます。DNAファミリーシャッフリングは、Error-prone PCRのような他の変異誘発法と組み合わせて利用されることもあります。

実験データ

図1. (NNK)11プラスミドライブラリーのヌクレオチド組成。ライブラリーはNNK縮重コドンを用いて構築された。各バーはヌクレオチドの位置を表し、色は観察されたヌクレオチドを示す。すべての位置で、理論値（N = 25% A, 25% T, 25% G, 25% C, K = 50% T, 50% G）に近い頻度で予想されるヌクレオチドが観察された。

図2．7merの可変領域をもつプラスミドライブラリーにおけるアミノ酸の分布。ライブラリーはNNK縮重コドン戦略を用いて構築した。各バーは、特定のアミノ酸または停止コドンの理論的割合（水色）または実際の割合（ピンク色）を表す。全20アミノ酸と停止コドン頻度の観察結果は、理論的頻度とほぼ一致した。

図3. ベクタービルダーで構築したライブラリーのサイズ、カバレッジ、アライメント率。(A) 製造したライブラリーの複雑さは10²から>10⁵の範囲となり、非常に多岐にわたる。(B)カバレッジとリードのアラインメント率はともに非常に高く、弊社のライブラリーのカバレッジとエラー率の低さが際立つ。