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昆虫細胞タンパク質発現システム

組換えタンパク質を真核生物で発現させるために、目的遺伝子を発現するバキュロウイルスを高密度の昆虫細胞培養に感染させることは、最も強力で幅広く利用される手法です。昆虫細胞発現システムは真核生物の翻訳後修飾の大部分とタンパク質のフォールディングを維持することができます。大腸菌細胞で生産された場合に、適切なリン酸化やフォールディングがされないために不活性なままである可能性があるキナーゼやステロイド受容体の生産には、昆虫細胞タンパク質発現システムが適しています。

特長

  • 真核生物がもつ重要なタンパク質修飾が可能
  • 複数の昆虫細胞株が利用可能
  • 分子量の大きなタンパク質の生産に有用
  • 分泌タンパク質、細胞内タンパク質、膜結合タンパク質の生産に適している

サービスの詳細

 Insect cell protein expression workflow

価格と作業日数  プライスマッチ 
サービス 説明 納品物 価格(JPY) 作業日数
ベクター設計とクローニング ベクター設計には、発現遺伝子の選択、精製タグの選択、コドンの最適化が含まれる。続いて遺伝子合成を行い、pBVバキュロウイルス導入ベクターへのクローニングを実行 プラスミドDNA 25,000円 1-2週
パイロットスケールの発現および精製 パイロットスケールの発現および精製
  • 0.5-1 mg精製タンパク質(可能であれば)
  • COA
372,000円 7-8週
Hi-5細胞やSf9細胞などの昆虫細胞にバキュロウイルスを感染させる。可能であれば、0.1-0.5mgの精製標的タンパク質*を製造し、品質管理(QC)を行う
大規模製造条件での発現と精製 100mgを超えるタンパク質製造へのスケールアップ
  • Up to 100+ mg 精製タンパク質
  • COA
お問い合わせください

* 精製方法は、発現ベクターのデザインとタンパク質の特性に基づいて決定されます。 

納品と保存方法

ベクター作製サービスのデフォルトの納品物は 1‐2ugのプラスミドDNAです。ご要望があれば、大腸菌グリセロールストックをご提供することも可能です。当社の組換えタンパク質のほとんどは凍結状態のドライアイス便で納品されます。納品後は、無菌状態で-20℃~-80℃で保存してください。組換えタンパク質は、適切に保存されれば、通常1年間は安定した状態を保ちます。組換えタンパク質が納品されたら、分注を行い、凍結融解サイクルを避けることをお勧めします。

品質管理(QC)

ベクタービルダーによってクローニングされたベクターはすべて100%の配列保証がなされます ベクタービルダーの組換えタンパク質は、厳格な品質管理を受けながら生産されます。ほとんどの発現システムの標準QCには、1) 制限酵素切断解析とサンガーシークエンスによるタンパク質発現ベクターの検証、2) A260/280測定とSDS-PAGEによるタンパク質濃度と純度の決定が含まれます。以下の表に示されている一般的な追加QCサービスは、ご要望に応じて提供可能です。

追加QCサービス 方法
エンドトキシン試験 LAL
エンドトキシン試験 ウェスタンブロット
インタクト質量分析 (還元条件)
SEC-HPLC
SEC-MALs
タンパク質N末端シーケンシング
宿主細胞タンパク質試験
タグ除去 プロテアーゼ分解
カイネティクスとアフィニティー分析/td> Octet
Biacore
げっ歯類用病原体検査パネル

技術情報

ベクターシステム

昆虫細胞システムで組換えタンパク質を発現させるために、目的遺伝子(GOI)をベクタービルダーのpBVベクターの強力なプロモーター下流にクローニングします。この発現カセット全体は、Tn7トランスポゾンターミナルエレメントであるTn7LとTn7Rのあいだに配置されています。このベクターを、bacmidシャトルベクターとヘルパープラスミドを持つ大腸菌に形質転換します。bacmidはlacZ遺伝子とlacZコード領域に挿入されたattTn7ドッキングサイトを持つように改変されたバキュロウイルスのゲノムを含む非常に大きなプラスミドです。ヘルパープラスミドはTn7トランスポザーゼを発現します。Tn7トランスポザーゼは、GOIと薬剤耐性遺伝子の発現カセットを含むpBVベクター上のTn7RとTn7Lに挟まれた領域を、bacmidのattTn7ドッキング部位に転移させます。組換えbacmidが導入されたコロニーは、薬剤選択と青/白スクリーニングによって同定されます(非組換えコロニーはlacZ発現により青色、組換えコロニーはトランスポゾン挿入によるlacZの破壊により白色を示す)。精製したbacmid DNAを昆虫細胞にトランスフェクションして、生きたバキュロウイルス(P1)を作製します。P1バキュロウイルスを昆虫細胞で適当なタイターになるまで増幅後に、昆虫細胞に感染させて目的の組換えタンパク質を産生させます。

ベクタービルダーのバキュロウイルスタンパク質発現ベクターシステムの詳細については、ベクターガイドをご覧ください。

図1. バキュロウイルス-昆虫組換えタンパク質発現ベクターマップ。

ケーススタディ
Insect cell protein expression

図2. 昆虫細胞で生産された組換えタンパク質の特性解析。(A)SDS-PAGE分析により、組換えタンパク質の分子量と95%以上の純度を確認した。(B)SEC-HPLCにより95%以上の純度が再確認された。(C)組換えタンパク質の生物学的活性を細胞増殖アッセイで測定した。ED50は2〜11ng/ml。

ご注文方法

ユーザー提供のプラスミドDNAを使用したタンパク質生産

ユーザー提供のプラスミドDNAを使用する場合は、マテリアルサブミッションガイドライン. に従ってマテリアルを準備し、弊社に発送してください。ユーザーからご提供されるマテリアルは、ベクタービルダーで受け取り後、品質検査(QCチェック)に合格することを必須条件としています。QCチェックは、マテリアルごとに16,000円からの追加料金が発生する場合があります。QCチェックに合格するまで、ご依頼のサービスが開始することができないことをご了承ください。

Q&A

どの組み換えタンパク質合成システムを選ぶべき?

すべての組換えタンパク質発現システムには長所と短所があります。それらを考慮してプロジェクトに最適なシステムを選択してください。以下の表に各システムの長所と短所をまとめました。

組み換えタンパク質発現システム 長所 短所
大腸菌
  • 費用対効果がたかい
  • 生産に必要な時間が短い
  • 技術的にシンプル
  • スケールアップが容易
  • 高いタンパク質収率
  • タンパク質の翻訳後修飾がない
  • コドン使用法が真核生物と異なる
  • 封入体への蓄積のため、特定のタンパク質の発現が難しい
  • 一部の毒性を持つタンパク質による細菌の増殖阻害の可能性
哺乳類細胞
  • 必要なすべての翻訳後修飾と適切なフォールディングがなされた、最も自然な状態のタンパク質を生成できる
  • 分泌タンパク質や膜タンパク質生産に適している
  • 治療用タンパク質の生産に最適
  • 生産に必要な時間が長い
  • 培養条件が複雑
  • スケールアップが困難
  • 収率が低いため、細胞内タンパク質生産には適さない
昆虫細胞
  • 複雑な翻訳後修飾の大部分とタンパク質のフォールディングが可能
  • 分泌タンパク質、細胞内タンパク質、膜タンパク質生産に適している
  • 大きなタンパク質複合体の生産にも使用可能
  • 他の真核生物発現系と比較して高いタンパク質発現量が可能
  • 高密度の懸濁細胞培養による高いスケーラビリティ
  • 生産に必要な時間が長い
  • 培養条件が複雑
  • 高い技術が必要
無細胞系
  • 3時間で完了する時間効率の良い合成効率
  • 生細胞を使わない有毒タンパク質、複雑なタンパク質、不安定なタンパク質の生産
  • ハイスループットなタンパク質発現とスクリーニングに最適
  • 自動化プロセスに適合する簡単な手順
  • 条件の最適化が容易
  • 条件設定の幅が限定的
どのタンパク質タグを使うべき?

タグは組換えタンパク質生産に頻繁に利用されます。タグによって精製工程を合理化でき、ある種のタグはタンパク質の溶解度、収量、純度の向上に寄与します。タグがプロテアーゼ切断部位のとなりに配置されていれば、精製後に除去することができます。切断効率は標的タンパク質によって異なります。タンパク質発現と精製にとって、適切なタグを注意深く選択することは極めて重要です。以下の表に、一般的に使用されるタグの概要、その利点と限界をまとめました。

タグ よく使用されるシステム 利点 限界
GST 大腸菌、昆虫細胞
  • タンパク質のネイティブな構造をほぼ保持できる
  • マイルドな条件下でタンパク質の精製が可能
  • 切断が容易
  • タンパク質の溶解性と発現量を高める
  • タグの分子量が大きい
  • 二量体化により標的タンパク質に影響を与える可能性
  • 変性条件下でのタンパク質精製には適さない
His すべて
  • タグのサイズが小さいため、タンパク質の構造への影響が少ない
  • コストが低い金属アフィニティークロマトグラフィーが使用できる
  • 免疫原性が低い
  • 変性条件下でのタンパク質精製に適している
  • 細胞に内在する他の金属結合タンパク質が共精製される可能性があるため、通常は最適化が必要
  • タンパク質のフォールディングと溶解性を高めることはない
SUMO 大腸菌、昆虫細胞
  • タンパク質のフォールディングを促進
  • タンパク質の溶解性と発現量を高める
  • 他の大腸菌タンパク質による非特異的切断を受ける可能性
  • 変性条件下でのタンパク質精製に不適
Flag 哺乳類細胞、昆虫細胞
  • タグのサイズが小さいため、タンパク質構造への影響が少ない
  • 検出が容易
  • 非特異的結合が少ない
  • 高純度の精製が難しい
MBP 大腸菌、昆虫細胞
  • タンパク質の溶解性と発現量を高める
  • タグの分子量が大きい
  • 変性条件下でのタンパク質の精製に不適
Fc 哺乳類細胞、昆虫細胞
  • タンパク質の溶解性と発現量を高める
  • 分泌タンパク質に最適
  • タグの分子量が大きい

タグに関する詳細については、プロテインタグページをご覧ください。

どの昆虫細胞株をタンパク質の発現に使うべき?

バキュロウイルスの作製や組換えタンパク質の発現に最も広く使用されている昆虫細胞株は、Sf9細胞およびSf21細胞(ツマジロクサヨトウ、Spodoptera frugiperda由来)、およびHi-5細胞(キャベツルーパー、Trichoplusia ni由来)です。下の表に、それぞれの細胞株の特徴をまとめました。

Hi-5 SF9, SF21
  • 高品質のバキュロウイルス作製
  • 分泌型組換えタンパク質の生産に最適
  • 浮遊細胞培養にも使用可能
  • 単層培養では増殖中に不規則なレイヤーが形成される傾向があり、プラークの同定が困難になる
  • 高品質のバキュロウイルス作製
  • あらゆる組換えタンパク質生産に最適
  • 単層培養および浮遊細胞培養の両方に使用可能