自己不活化型MMLVレトロウイルスCAR (キメラ抗原受容体) 発現ベクター

概要

将来性のあるガン治療法として、キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR）を利用して腫瘍関連抗原を認識するT細胞（CAR-T細胞）を作製する方法が注目されています。CAR-T細胞療法は患者本人から採取されたT細胞（自家）もしくは健康なドナーから採取されたT細胞（同種）にCARを発現させ、抗原への結合によって腫瘍細胞を標的としてT細胞が活性化するように設計します。

CARは4つのコンポーネントから構成されています。1) 細胞外抗原認識ドメイン。特異性が確認されているモノクローナル抗体由来の単鎖可変領域フラグメント（scFv）から構成される。scFvは抗原特異的モノクローナル抗体の可変領域の軽鎖と重鎖がリンカーペプチドで連結された構造をしている。2) 細胞外ヒンジ。scFVを膜貫通ドメインに連結してCARの安定性と柔軟性をもたらす。3) 膜貫通ドメイン。CARを細胞膜につなぎ留め、抗原結合ドメインと細胞内シグナルドメインの橋渡しをする。受容体の発現と安定性を高めるために重要な役割を果たす。4) 細胞内シグナルドメイン。T細胞受容体（TCR）のCD3-zetaドメイン由来でありITAMs (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)を内包している。ITAMsは抗原への結合とともにリン酸化されて下流シグナル伝達系を活性化してT細胞を活性化します。さらに細胞内シグナルドメインに複数の（CD28、CD137由来など）共刺激ドメインを加えることで、T細胞の増殖性と持続性を上昇させることができます。

CARは過去数年にわたる細胞内シグナルドメインの改良によって進化しています。第一世代CARはCD3-zeta シグナルドメインだけを持っていました。第一世代CARを発現するT細胞は活性化できるものの、細胞毒性と増殖率が低いためにin vivoでの抗腫瘍活性が貧弱でした。続いてCD3-zetaシグナルドメインに加えて共刺激ドメインを付加した第二世代CARの出現によって、CAR‐T細胞のin vivo増殖性、拡張性および持続性の大幅な改善をもたらしました。CD3-zetaドメインに加えて2つのシス共刺激ドメインを細胞内シグナルドメインに付加した第三世代CARは抗腫瘍活性をさらに改善しました。第二世代CARを基に開発された第四世代CARは恒常的もしくは誘導的にサイトカイン発現する様に改良した細胞内シグナルドメインをもちます。同様に第二世代CARを基に開発された第五および最新世代CARはサイトカイン受容体の細胞内シグナルドメインを組み込んでいます。

当社のMMLVレトロウイルスCAR発現ベクターはモロニーマウス白血病ウイルスを基に開発され、レトロウイルスを介した第二世代CARをT細胞に導入する目的に非常に敵しています。

MMLVはモロニーマウス白血病ウイルスに由来するレトロウイルスベクターで、効率的にゲノムインテグレーションを実現するプラス鎖直鎖RNAウイルスです。野生型MMLVレトロウイルス遺伝子発現ベクターでは5' long terminal repeat (LTR) 内にあるユビキタスな発現を誘導するプロモーターを利用してCARカセットを発現させますが、自己不活化型MMLVレトロウイルスCAR発現ベクターではCARカセットを発現誘導するプロモーターはユーザーが選択できます。これはMMLV 3’LTRのU3領域を欠失させると5' LTRにあるプロモーターが不活化する（自己不活性化）ことを利用しています。この仕組みはCARカセットを発現させるためのプロモーターの選択の幅を広げるだけでなく、ベクターインテグレーション（ゲノムへの挿入）による近傍遺伝子への影響により心配されるガン化リスクを軽減させ、野生型MMLVベクターよりもさらに安全性を高められます。

MMLVレトロウイルスCAR発現ベクターはE.coli用プラスミドとして作製され、CAR発現カセット（scFV領域、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内CD3 zetaシグナルドメインと共刺激ドメインを含む）は２つのMMLV　LTR（long terminal repeats）のあいだにクローニングされます。MMLVレトロウイルスCAR発現ベクターはヘルパープラスミドとともにパッケージング細胞に導入され、ベクター内のLTRのあいだのCAR発現カセットがウイルスRNAに転写されます。ヘルパープラスミドから発現したウイルスタンパク質群がウイルスRNAをウイルスにパッケージングします。こうして作られたウイルスは上清に放出され、直接もしくは濃縮した後に標的細胞への感染に用いられます。ウイルスが標的細胞に感染するとRNAゲノムは細胞内に注入、そしてDNAに逆転写された後に宿主ゲノムへ挿入されます。こうして２つのLTR間にあるCAR発現カセットとウイルスゲノムは宿主ゲノムへ挿入され、恒久的に維持されます。

当社のMMLVレトロウイルスベクターはウイルスのパッケージングや感染に必要になる遺伝子群が取り除かれています。これらの遺伝子はヘルパープラスミドから提供されます。MMLVレトロウイルスベクターによって生産されるウイルスは複製不能（細胞に感染はできるが複製はできない）なので安全です。

本ベクターシステムの詳細については、以下の文献をご参照下さい。

参考論文	トピックス
Br J Cancer. 120:26 (2019)	Review on next-generation CAR T cells
Mol Ther Oncolytics. 3:16014 (2016)	Review on CAR models
J Immunother. 32:169 (2009)	MMLV retrovirus-mediated CAR expression for autologous adoptive cell therapy
J Immunother. 32:689 (2009)	Construction and pre-clinical evaluation of an anti-CD19 CAR
Mol Ther. 11:1919 (2009)	Insertional transformation of HSCs by SIN MMLV

特長

自己不活化型（SIN）MMLV レトロウイルスCAR発現ベクターは第二世代のCARを発現するようにデザインされています。大腸菌での高コピー数複製、生ウイルスの高力価パッケージング、幅広い細胞への効率的なウイルス導入、宿主ゲノムへの効率的なベクターインテグレーション、および導入遺伝子の高レベル発現のために最適化されています。

メリット

ベクターDNAの恒久的な組み込み: 一般的なトランスフェクションでは、ベクタープラスミドは時間の経過と共に失われるため、DNAの導入は一過性で、分裂速度の早い細胞においては特に不安定となります。しかしながら、レトロウイルスでは、宿主ゲノムへ組み込まれるため、恒久的に遺伝子を導入することができます。

広範な組織指向性: 当社のパッケージングシステムではウイルス表面にVSV-Gエンベロープタンパク質を発現させています。VSV-Gエンベロープタンパク質は幅広い指向性を持つため、非分裂細胞を除き、一般的によく用いられる生物種（哺乳動物以外のいくつかの生物種においても）由来の細胞に効率よく導入することができます。

プロモーターを選択可能: 5’LTRのプロモーターはゲノム挿入時に自己不活化するようにデザインされているため、ノンコーディングRNAを駆動するプロモーターをユーザーが選択することができます。野生型MMLVレトロウイルスベクターでは、5’LTRのプロモーターによってユビキタスに発現させることしかできないため、大きな利点となります。

遺伝子導入の均一性が高い: 一般的に、ウイルスによる導入は比較的バラツキが少なく、細胞間で均一にベクターを導入することができます。反対に、一般的なトランスフェクション法では、ある細胞では高コピー数、またある細胞では低コピー数あるいは全く導入されないなど、プラスミドベクターの導入は非常に不均一になります。

In vitroとin vivoでの使用: 主にin vitroで培養細胞の導入に使用されますが、生きた動物の細胞へ導入する場合にも使用することができます。

安全への配慮: 本ベクターの安全性は2つの特徴によって保証されています。まず、ウイルスパッケージングと導入に必須な遺伝子を複数のヘルパープラスミドに分散し、安全性を高めています。また、ゲノムに挿入される際に5' LTRのプロモーター活性が自己不活化するため、パッケージングと導入の間に複製能を持つウイルスが出現することは本質的に不可能です。

デメリット

中程度のウイルス力価: パッケージング細胞上清から得られるウイルス力価は、濃縮をしない場合～10⁷ TU/mlで、レンチウイルスよりも1桁程度低くなります。

野生型MMLVよりも限られたカーゴスペース: MMLVレトロウイルスのゲノムは約8.3 kbです。当社のベクターでは、ウイルスのパッケージングとトランスダクションに必要なコンポーネントが2.6-3 kbを占めており、ノンコードRNAとプロモーターを含むユーザーの目的のDNAを収容できるサイズは5.3-5.7 kbまでと制限されます。

非分裂細胞への導入が困難: 非分裂細胞への導入は困難です。

技術的な難しさ: MMLVウイルスベクターを形質導入に使う前に、ウイルス産生細胞に複数のプラスミドDNAをトランスフェクトして、生きたウイルス粒子を作成させ、精製し、ウイルスのタイターを測定するなど、形質導入までにこなさなければならない様々な作業があります。これらの作業は、一般的なプラスミドのトランスフェクション法に比べ、技術的に習熟するまでの期間や、さらに実際のウイルス作製日数も長くかかります。

基本コンポーネント

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. パッケージング細胞でウイルスRNAの転写を促進し、転写されたRNAはウイルス粒子にパッケージングされます。

MMLV 5' LTR-ΔU3: 欠損型 MMLVレトロウイルス5' long terminal repeat. 野生型MMLVレトロウイルスでは 5' LTR と3' LTR は全く同じ配列です。ウイルスゲノムの両末端に位置し、配列の向きが内側に同じになるようになっています。ウイルスがゲノムに挿入される際に3' LTR 配列は5' LTRにコピーされます。 LTRsは両方ともプロモーターとポリアデニル化の機能を持っており、5’LTRは転写を促進するプロモーターの役割をし、3’LTRは転写を終結させるためにポリアデニル化を誘導します。本ベクターではMMLV 5' LTR-ΔU3 はLTRのプロモーター活性に必要な領域を欠失させてあります。Δ5' LTRの上流にCMVプロモーターが組み込まれているため、この欠失によりウイルスRNAのパッケージングに影響が出ることはありません。

Ψ plus pack2: MMLVレトロウイルスRNAのパッケージングに必要なシグナル。

Promoter: ここに目的遺伝子を発現させるプロモーターを配置します。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

CD8-leader: T細胞表面の糖タンパク質CD8 alphaドメインのシグナルペプチド。タンパク質のT細胞表面への輸送と局在に必要。

scFv: 特異性が確認されているモノクローナル抗体由来の単鎖可変領域フラグメント。抗原特異性にしたがって細胞を認識する。

Hinge: CARの細胞外ヒンジ領域。scFVと膜貫通ドメインを連結して、CARタンパク質発現と機能の安定性と柔軟性をもたらす。

Transmembrane domain: CARの膜貫通ドメイン。CARを細胞膜につなぎ留め、抗原結合ドメインと細胞内シグナルドメインの橋渡しをする。受容体の発現と安定性を高める。

Costimulatory domain: CARの細胞内共刺激ドメイン。CAR-T細胞の生存率、増殖率および活性化状態の持続性を上昇させる。

CD3zeta: Intracellular domain of the T cell receptor-CD3ζ chain. Acts as a stimulatory molecule for activating T cell-mediated immune response.

CD3zeta: T細胞受容体のCD3ζ鎖。T細胞による免疫反応を活性化する。

WPRE: Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element. パッケージング細胞内でのウイルスRNAの安定性を高め、ウイルス粒子にパッケージングされるタイターを向上させます。

MMLV 3' LTR-ΔU3: U3欠損型MMLVレトロウイルスの3’long terminal repeat (LTR) です。この変異型3’LTRは、ウイルスベクターが宿主ゲノムにインテグレーションされる際に5’LTRが3’LTRからコピーされるため、5’LTRのプロモーターは活性を失います。 MMLV 3' LTR-ΔU3 のポリＡ付加シグナルは、上流ORFの転写を終結させます。

SV40 late pA: シアミンウイルス40 （Simian virus 40）後期ポリA付加シグナル。3’LTRの下流でORFの転写終結するために重要で、ウィルスタイターを向上させます。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。