Vector Systems
pUASTB ショウジョウバエ用遺伝子発現ベクター
概要
当社のpUASTBベクターシステムはトランスジェニックハエの高効率な作製と導入した遺伝子の発現制御を実現します。当システムはP因子トランスポゾンシステムとφC31インテグラーゼシステムの両方が組み込まれているうえにGal4誘導型プロモーターによる強力な遺伝子発現制御が可能です。そのため、pUASTBベクターはP因子トランスポゾンとφC31インテグラーゼのどちらかを選択して使用することができます。どちらの場合でも、目的の遺伝子は2つのP因子TR（terminal repeat）の間にあるattBサイトの近傍にクローニングされます。
P因子トランスポゾンによるゲノム挿入を利用する場合、pUASTBとP因子トランスポゼースをもつヘルパープラスミドを宿主細胞もしくは胚に同時に導入します。ヘルパープラスミドから発現したトランスポゼースはpUSASTBの2つのP因子TRとそのあいだの領域を宿主ゲノムへ挿入します。遺伝子配列の挿入される配列に明確なバイアスはありません。
φC31インテグラーゼによるゲノム挿入に利用する場合はpUASTBとφC31インテグラーゼをもつヘルパープラスミドをattPサイトをもつ宿主細胞もしくは胚に同時に導入します。φC31インテグラーゼはattPとattBのあいだで組み換えを起こしてpUASTBを宿主ゲノムへ挿入します。
pUASTBベクターのmini white遺伝子は目の色を決定し、遺伝子導入が成功したトランスジェニックハエの同定に使われます。
pUASTBベクターシステムでは、目的の遺伝子はGal4結合サイトが5つ直列に並んだ5xUASとhsp70 TATAボックスプロモーターをつなげた誘導型プロモーター（5×UAS/mini_Hsp 70）の下流にクローニングされます。GAL4/UASシステムはGal4に依存した発現誘導ができるように設計されています。Gal4タンパク質はUASに結合して転写を制御するため、Gal4非存在下では下流の遺伝子は転写されませんが、Gal4を発現しているショウジョウバエ株との交配よって転写は活性化されます。
当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください
| References | Topic |
|---|---|
| Development. 118:401 (1993) | Development and use of the pUAST inducible promoter system |
| Methods Mol Biol. 420:61 (2008) | The use of P-element transposons to generate transgenic flies |
| Proc Natl Acad Sci U S A. 97:5995 (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 95:5505 (1998) |
Description of the φC31 integrase system |
| Proc Natl Acad Sci U S A. 104:3312 (2007) | Use of pUASTattB and germ-line-specific φC31 integrase to construct transgenic Drosophila |
| Genetics. 166:1775 (2004) | Use of pUASTB to construct transgenic Drosophila |
特長
当社のpUASTBショウジョウバエ遺伝子発現ベクターはP因子トランスポゼースもしくはφC31インテグラーゼのどちらかを利用した目的遺伝子のゲノム挿入と、Gal4による発現誘導を実現します。当社のベクターはE.coliでの高コピー数複製とトランスジェニックハエの高効率な作製が可能です。
メリット
配列特異的な挿入: φC31インテグラーゼはattPサイトで配列特異的な挿入を引き起こしますが、その他のゲノム配列への挿入は起こりません。そのため宿主の遺伝子を破壊したり、挿入部位の位置効果によって導入した遺伝子の発現が影響を受ける危険を減らすことができます。
高レベル発現: 5×UAS/mini_Hsp70プロモーターは活性化状態で高い発現量を示します。
発現誘導が可能: 導入した遺伝子はGal４非存在下でほとんど発現しませんが、Gal４が存在すると高レベルで発現します。
高効率：φC31インテグラーゼをもちいた生殖細胞への遺伝子導入はP因子トランスポゾンを利用したpUASTシステムよりも高効率です。
デメリット
ゲノムへのランダムな挿入: P因子トランスポゾンによるゲノム挿入を選択した場合、P因子のランダムなゲノムへの挿入は挿入場所の特定が難しく、挿入場所によっては導入された遺伝子の発現に影響を与えます。遺伝子が宿主遺伝子もしくは転写制御因子の配列に挿入され、それらの機能を破壊する可能性もあります
発現“漏れ”の可能性:Gal４非存在下でも目的の遺伝子が低いレベルで発現することがあります。
技術的な煩雑さ: トランスジェニックハエの作製は胚へのインジェクションやハエの飼育・交配など、高い技術が要求されます。
attPサイトが必要：φC31インテグラーゼによるゲノム挿入を選択した場合、トランスジェニックハエの作製にはあらかじめattPサイトがゲノムに導入された特別な宿主株が必要です。
基本コンポーネント
P-element 3’ end: P因子の右TR（terminal repeat）もしくは3’TR。DNA配列がP因子5‘TRと3‘TRで挟まれている場合、Pトランスポゼースは両TRに挟まれている領域を宿主ゲノムに挿入する。
5×UAS/mini_Hsp70: ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の熱ショックタンパク質Hsp70の最小プロモーターと5×UASを連結したプロモーター。Gal4によって強力に活性化されるプロモーター。
Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。
ORF: 目的遺伝子のORFをここに配置する。
SV40 terminator: SV40（Simian virus 40）のポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写停止を助ける。
attB site: バクテリオファージφC31インテグラーゼによって認識されるattBサイト。φC31インテグラーゼは宿主ゲノムにあらかじめ導入されているattPサイト特異的にpUASTBプラスミドを挿入する。
mini-white: ショウジョウバエのwhite遺伝子の派生型。ミニホワイト遺伝子は成体ショウジョウバエの目の色に関する優性マーカーであり、white遺伝子変異体をバックグラウンドとした遺伝子導入の成否の判断に使用する。
P-element 5’ end: P因子の左側TR（terminal repeat）もしくは5’TR。DNA配列がP因子5‘TRと3‘TRで挟まれている場合、Pトランスポゼースは両TRに挟まれている領域を宿主ゲノムに挿入する。
pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。
Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。