標準プラスミドFLEX(Cre-Switch)条件的遺伝子発現ベクター

概要

当社の標準プラスミドFLEX(Cre-Switch)条件的遺伝子発現ベクターは哺乳類細胞と生体でCreを利用した2種類の遺伝子の発現切り替えを可能にするCre応答性FLEX (Cre‐switch)が組み込まれています。FLEX (Cre‐switch)スイッチはアンチパラレル方向に配置された遺伝子対の両端に2ペアのLoxPバリアント組み換え配列が配置された構造をしています。片方の遺伝子の発現は活性化状態、もう一方の遺伝子発現は不活性化状態にあり、Creによる遺伝子対の反転によって両遺伝子の活性化状態が切り替わります。

FLEX (Cre‐switch)システムは2ペアのLoxPバリアント(オリジナルのLoxPと変異が導入されたLox2272)組み換え配列から構成されています。プロモーター下流の遺伝子対(遺伝子#1と遺伝子#2)の両側にLoxPペアとLox2272ペアの片側がひとつずつ配置されています。両方のLoxPバリアントはCreに認識されますが、同じLoxP配列間でのみ組み換えが発生します。遺伝子対は3’端を向かい合わせる形で逆向きに配置されており、発現用プロモーターに対して遺伝子#1はセンス方向、遺伝子#2はアンチセンス方向をとります。LoxPとLox2272はLox2272‐LoxPの順番で、アンチパラレル配向で配置されます。Cre非存在条件では使用するプロモーターの活性制御にしたがって遺伝子#1が発現されますが、遺伝子#2はアンチセンス方向をとっている為に発現しません。Cre存在条件では、まずLoxPペアもしくはLox2272ペアのどちらか一方で起こった組み換えによって遺伝子対の反転が起こります。遺伝子対の反転の結果、遺伝子#1はアンチセンス方向となり発現は不活性化され、遺伝子#2がセンス方向になることで発現が活性化されます。

当ベクターシステムはトランスジェニック動物の作製に特に適していますが、培養組織細胞にも利用することも可能です。当ベクターが導入されたトランスジェニック動物個体は初期状態で遺伝子#1を発現しています。組織特異的にCreを発現する個体を交配することで、当ベクターとCreの両方を受け継いだ子孫が生まれます。そのような子孫個体ではCreが特異的に発現し、かつ使用しているプロモーターが活性化している細胞で遺伝子#1の発現の不活性化と遺伝子#2の活性化が生じています。

当ベクターシステムを培養細胞に使用する際には、抗生物質または蛍光マーカー遺伝子を組み込むことで恒久的にベクターがゲノムに挿入されている細胞の選別が可能になります。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報については下記の論文を参照してください

References Topic
Gene. 216:55 (1998) Characterization of LoxP mutants, including Lox2272
Nat Biotechnol. 21:562 (2003) Development of the FLEX switch system
J Neurosci. 28:7025 (2008) Application of a FLEX system

特徴

当ベクターは哺乳類細胞と生体でCreを利用して2つの遺伝子の発現状態を条件的に切り替えることができます。使用するプロモーターの活性制御にしたがって遺伝子は発現され、Creレコンビナーゼの共発現によって遺伝子する発現の切り替えが起こります。

メリット

厳密な遺伝子発現切り替え: 遺伝子ペアは逆向きに配置されているため、センス方向にある遺伝子が発現する一方、アンチセンス方向にある遺伝子の発現は完全に抑制されます。

簡便さ:プラスミドベクターは従来の方法によって細胞に導入されます。パッケージング操作が必要なウイルスと比べると非常に簡便です。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のベクターは全体で~30kbのDNA配列を扱うことができます。当ベクターのバックボーン部分は3kbほどですので、残りを任意の目的で使用することができます。

高レベル発現:従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法はしばしば非常に高いコピー数(数千コピー)を細胞に導入できます。これらの細胞は非常に高い発現量を持ちます。

in vivo用途に適している: 当ベクターは培養組織細胞への利用もできますが、Creを介した条件的遺伝子発現を目的としたトランスジェニック動物の作製に適しています。 

デメリット

ベクターDNAがゲノムへ挿入されない:培養細胞に対してプラスミドベクターを使用した場合、非常に低い頻度(細胞タイプによって102-106細胞あたり1回)でのみ宿主ゲノムへ挿入されます。薬剤耐性や蛍光マーカーがプラスミドベクターに組み込まれているならば、薬剤選択やセルソーターによって挿入が起こった細胞を選別できます。

細胞タイプが限定される:プラスミドベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存し、しばしば条件の最適化が必要です。プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプへの遺伝子導入は非常に困難になります。

導入コピー数にばらつきが大きい:細胞あたりに導入されるベクターの平均コピー数は非常に高くなりますが、ばらつきが大きくなります(ある細胞は非常に高コピー数だが、別の細胞は数コピーしかない、等)。一方でウイルスによる遺伝子導入法はこのようなばらつきは小さくなる傾向があります。

基本コンポーネント

Promoter: 目的遺伝子を発現するプロモーター。

Lox2272: Creレコンビナーゼの組み換え配列。LoxP配列に二か所の塩基置換が導入されている。LoxP配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

LoxP: Creレコンビナーゼの組み換え配列。Lox2272配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF #1: 遺伝子#1。センス方向に配置され、Creによる組み換え反応前に発現する。

ORF #2: 遺伝子#2。アンチセンス方向に配置され、Creによる組み換え反応後に発現する。

SV40 late pA: SV40(Simian virus 40)のlateポリアデニレーションシグナル。上流遺伝子の転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子(ネオマイシン耐性など)や視覚化用遺伝子(EGFPなど)、もしくはデュアルレポーター遺伝子(EGFP/Neoなど)。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。マーカー遺伝子の転写を停止する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。