PiggyBac FLEX(Cre-Switch)条件的遺伝子発現ベクター

PiggyBac FLEX(Cre-Switch)条件的遺伝子発現ベクターはベクタービルダー社の高効率なpiggyBacベクターシステムとCre応答性FLEX条件的遺伝子発現システムを組み合わせることによって、２種類の遺伝子の発現を切り替えるCre応答性FLEXスイッチを宿主細胞ゲノムに恒久的に挿入できます。FLEX (Cre‐switch)スイッチはアンチパラレル方向に配置された遺伝子対の両端に2ペアのLoxPバリアント組み換え配列が配置された構造をしています。片方の遺伝子の発現は活性化状態、もう一方の遺伝子発現は不活性化状態にあり、Creによる遺伝子対の反転によって両遺伝子の活性化状態が切り替わります。

FLEX (Cre‐switch)システムは2ペアのLoxPバリアント（オリジナルのLoxPと変異が導入されたLox2272）組み換え配列から構成されています。プロモーター下流の遺伝子対（遺伝子#1と遺伝子#2）の両側にLoxPペアとLox2272ペアの片側がひとつずつ配置されています。両方のLoxPバリアントはCreに認識されますが、同じLoxP配列間でのみ組み換えが発生します。LoxPとLox2272はLox2272‐LoxPの順番で、アンチパラレル配向で配置されます。遺伝子対は3’端を向かい合わせる形で逆向きに配置されており、発現用プロモーターに対して遺伝子#1はセンス方向、遺伝子#2はアンチセンス方向をとります。Cre非存在条件では使用するプロモーターの活性制御にしたがって遺伝子#1が発現されますが、遺伝子#2はアンチセンス方向をとっている為に発現しません。Cre存在条件では、まずLoxPペアもしくはLox2272ペアのどちらか一方で起こった組み換えによって遺伝子対の反転が起こります。遺伝子対の反転の結果、遺伝子#1はアンチセンス方向となり発現は不活性化され、遺伝子#2がセンス方向になることで発現が活性化されます。

PiggyBacベクターシステムはプラスミドベクターによって目的遺伝子を宿主細胞ゲノムに恒久的に導入できる、非ウイルス性の簡便なシステムです。PiggyBac FLEX (Cre‐switch)条件的遺伝子発現システムはE.coliプラスミドとして設計された2つのベクターから構成されます。ひとつめはヘルパープラスミドと呼ばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、２つのITR（inverted terminal repeats）のあいだに挿入予定DNA配列が組み込まれます。FLEX (Cre‐switch)スイッチはITRのあいだにクローニングされます。

ヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドが標的細胞に同時導入されると、ヘルパープラスミドから発現したトランスポゼースはトランスポゾンプラスミド上の2つのITRを認識してITRとFLEX (Cre‐switch)スイッチを宿主ゲノムへ挿入します。piggyBacトランスポゾンはゲノムのTTAA配列に挿入されます。挿入の過程でTTAA配列は複製されて挿入場所の両端に配置されます。遺伝子対の反転の結果、遺伝子#1はアンチセンス方向となり発現は不活性化され、遺伝子#2がセンス方向になることで発現が活性化されます。

当ベクターシステムは培養組織細胞に利用することができますが、トランスジェニック動物の作製に特に適しています。当ベクターが導入されたトランスジェニック動物個体と組織特異的にCreを発現する個体を交配することで、Creとベクターの両方を受け継いだ子孫が生まれ、Creが発現かつ使用するプロモーターが活性化している細胞において遺伝子#2の発現活性化と遺伝子#1の発現不活性化が起こります。

PiggyBacはクラスIIトランスポゾンであり、カット＆ペースト様式（転移後に自身のコピーを残さない）で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー＆ペースト様式をとります。ヘルパープラスミドは一過的に細胞内に導入され、時間経過とともに失われます。ヘルパープラスミドの宿主細胞からの消失によってゲノムへ挿入されたトランスポゾンは恒久的に固定化されます。ヘルパープラスミドが再導入された場合、トランスポゾンはゲノムの挿入位置から再び転移することがあります。

当ベクターシステムに関する詳細な情報については下記の論文を参照してください

PiggyBac FLEX(Cre-Switch)条件的遺伝子発現ベクターは哺乳類細胞と生体でCreを利用して2つの遺伝子の発現状態を条件的に切り替えることができます。使用するプロモーターの活性制御にしたがって遺伝子は発現され、Creレコンビナーゼの共発現によって遺伝子する発現の切り替えが起こります。

PiggyBac FLEX(Cre-Switch)条件的遺伝子発現ベクターとヘルパープラスミドはE.coliでの高コピー数複製、広範な標的細胞へ高効率なベクター導入および高レベルの遺伝子発現を可能にします。

厳密な遺伝子発現切り替え: 対となる遺伝子（遺伝子#1と遺伝子#2）は逆向きに配置されているため、センス方向にある遺伝子が発現する一方、アンチセンス方向にある遺伝子の発現は完全に抑制されます。

恒久的なベクターDNAの挿入： 従来の方法で宿主細胞へ導入されたベクターDNAはほとんどが時間経過とともに失われます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。piggyBacトランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドを使用した遺伝子導入法ならば、トランスポゾンを利用したベクターDNAの宿主ゲノムへの挿入によって恒久的な目的遺伝子の導入が可能です。

簡便さ：プラスミドベクターは従来の方法によって細胞に導入されます。パッケージング操作が必要なウイルスと比べると非常に簡便です。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のPiggyBac FLEX(Cre- Switch)条件的遺伝子発現ベクターは全体で~30kbのDNA配列を扱うことができます。当ベクターのバックボーン部分（トランスポゾン関連、およびCreレコンビナーゼ関連）は３.1kbほどですので、残りを任意の目的で使用することができます。

細胞タイプが限定される：PiggyBacベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。一般的に非増殖細胞は増殖細胞よりも導入効率が悪くなり、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。これらの細胞タイプによる限定はpiggyBacシステムにも当てはまります。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。piggyBacトランスポゼースは2つのITR（5' ITR と3' ITR ）を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

Promoter: 目的遺伝子を発現するプロモーター。

Lox2272: Creレコンビナーゼの組み換え配列。LoxP配列に二か所の塩基置換が導入されている。LoxP配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

LoxP: Creレコンビナーゼの組み換え配列。Lox2272配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272 配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF #1: 遺伝子#1。センス方向に配置され、Creによる組み換え反応前に発現する。

ORF #2: 遺伝子#2。アンチセンス方向に配置され、Creによる組み換え反応後に発現する。

rBG pA: ラビットβ-グロブリンポリアデニレーションシグナル。目的遺伝子の転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）や視覚化用遺伝子（EGFPなど）、もしくはデュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。マーカー遺伝子の転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。