標準プラスミドFLEX(Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクター

概要

当社の標準プラスミドFLEX(Cre-Off)条件的遺伝子発現ベクターは哺乳類細胞と生体でCreを利用して条件的に遺伝子発現を不活性化するためのCre応答性FLEX (Cre-Off)スイッチが組み込まれています。FLEX (Cre-Off)スイッチは目的遺伝子の両端に配置された2ペアのLoxPバリアント組み換え配列を利用してCre応答性の遺伝子方向の反転によって目的遺伝子の発現を強力に不活性化します。

FLEX (Cre-Off)スイッチは2ペアのLoxPバリアント(オリジナルのLoxPと変異が導入されたLox2272)組み換え配列から構成されています。プロモーターに対して順向き(センス方向)にクローニングされた遺伝子の両側にLoxPペアとLox2272ペアの片側がひとつずつ配置されています。LoxPとLox2272はLox2272‐LoxPの順番で、アンチパラレル配向で配置されます。Cre非存在条件では使用するプロモーター活性にしたがって遺伝子が発現されます。Cre存在条件では、まずLoxPペアもしくはLox2272ペアのどちらか一方で起こった組み換えによって遺伝子のアンチセンス方向への反転が起こります。遺伝子の反転によって目的遺伝子の発現は完全に抑制されます。続いて、残り一方のペアに組み換えが起こることによってLoxPペアとLox2272ペアの片側が取り除かれます。この結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272配列がひとつずつ配置され、Cre存在条件でもこれ以上の組み換え反応が起こることはありません。

当ベクターシステムはトランスジェニック動物の作製に特に適していますが、培養組織細胞にも利用することも可能です。当ベクターが導入されたトランスジェニック動物個体と組織特異的にCreを発現する個体を交配することでCreとベクターの両方を受け継いだ子孫が生まれ、Creが発現している組織細胞において遺伝子が部位特異的に不活性化されます。

当ベクターシステムを培養細胞に使用する際には、抗生物質または蛍光マーカー遺伝子を組み込むことで恒久的にベクターがゲノムに挿入されている細胞の選別が可能になります。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報については下記の論文を参照してください

References Topic
Gene. 216:55 (1998) Characterization of LoxP mutants, including Lox2272
Nat Biotechnol. 21:562 (2003) Development of the FLEX switch system
J Neurosci. 28:7025 (2008) Application of a FLEX switch system

特徴

当ベクターは哺乳類細胞と生体でのCreを利用した条件的遺伝子発現の不活性化を可能にします。初期状態では目的遺伝子は使用するプロモーターの活性制御にしたがって発現します。しかしCreレコンビナーゼの共発現によって遺伝子の向きの反転が起こり、発現が恒久的に不活性化されます。

メリット

厳密な遺伝子発現切り替え:Creによる組み換え反応よって目的遺伝子がアンチセンス方向へ反転するため、目的遺伝子の発現を完全に抑制します。

安定した遺伝子不活性化: Cre組み換え反応は目的遺伝子をプロモーターに対してアンチセンス方向に反転します。遺伝子の反転後に続いて起こる組み換え反応によって、LoxPバリアントペアのそれぞれ片側が取り除かれます。結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272がひとつずつ配置される形になり、Cre存在条件でもこれ以上の組み換え反応が起こることはありません。その結果として遺伝子発現の不活性化状態は恒久的に維持されます。

簡便さ:プラスミドベクターは従来の方法によって細胞に導入されます。パッケージング操作が必要なウイルスと比べると非常に簡便です。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のベクターは全体で~30kbのDNA配列を扱うことができます。当ベクターのバックボーン部分は3kbほどですので、残りを任意の目的で使用することができます。

高レベル発現:従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法はしばしば非常に高いコピー数(数千コピー)を細胞に導入できます。これらの細胞は非常に高い発現量を持ちます。

in vivo用途に適している: 当ベクターは培養組織細胞への利用もできますが、Creによる条件的遺伝子発現を目的としたトランスジェニック動物の作製に適しています。 

デメリット

ベクターDNAがゲノムへ挿入されない:培養細胞に対してプラスミドベクターを使用した場合、非常に低い頻度(細胞タイプによって102-106細胞あたり1回)でのみ宿主ゲノムへ挿入されます。薬剤耐性や蛍光マーカーがプラスミドベクターに組み込まれているならば、薬剤選択やセルソーターによって挿入が起こった細胞を選別できます。

細胞タイプが限定される:プラスミドベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存し、しばしば条件の最適化が必要です。プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプへの遺伝子導入は非常に困難になります。

導入コピー数にばらつきが大きい:細胞あたりに導入されるベクターの平均コピー数は非常に高くなりますが、ばらつきが大きくなります(ある細胞は非常に高コピー数だが、別の細胞は数コピーしかない、等)。一方でウイルスによる遺伝子導入法はこのようなばらつきは小さくなる傾向があります。

基本コンポーネント

Promoter: 目的遺伝子を発現するプロモーター。

Lox2272: Creレコンビナーゼの組み換え配列。LoxP配列に二か所の塩基置換が導入されている。LoxP配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

LoxP: Creレコンビナーゼの組み換え配列。Lox2272配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 発現させたい目的遺伝子が配置されるが、プロモーターの方向とは順方向。

SV40 late pA: SV40(Simian virus 40)のlateポリアデニレーションシグナル。上流遺伝子の転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子(ネオマイシン耐性など)や視覚化用遺伝子(EGFPなど)、もしくはデュアルレポーター遺伝子(EGFP/Neoなど)。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。マーカー遺伝子の転写を停止する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。