piggyBac抗体遺伝子（重鎖＋軽鎖）共発現ベクター

組換え抗体は診断薬や治療薬の分野で幅広く応用されています。現在、PD-L1、HER2、IL-17R、VEGFといった特定のタンパク質を標的とするモノクローナル抗体製品が、世界中で約180種類承認されています。遺伝子工学の発展により、理想的な腫瘍浸透作用、短い保持時間、免疫原性の低減を可能にし、これらの治療用抗体の生産を成功に導きました。これらの治療用組換え抗体は、主にin vitroの哺乳類細胞（例えばCHO細胞）で生産されます。この発現系における転写後修飾が、ヒトにおけるin vivoのプロセスに最も近いからです。

全ての抗体は重鎖と軽鎖を有し、両鎖は可変領域（V）と定常領域（C）から構成されています。抗原結合部位は VH+VL 二量体からなり、VH と VL はそれぞれ重鎖と軽鎖の可変フラグメントを表します。これらのフラグメントの中で、塩基配列の多様性（バリエーション）の大部分は相補性決定領域（CDR）に存在し、抗原結合特異性に影響を与えます。 哺乳類では、抗体は重鎖C領域の配列に基づいて5つのアイソタイプ（IgG、IgA、IgM、IgD、IgE）に分けられます。5つの免疫グロブリン（抗体）アイソタイプのうち、IgGが最も多く血液中に存在しています。さらに、承認された治療用抗体のバックボーンはほとんどすべてIgGです。特定のアイソタイプの抗体は、軽鎖C領域によってコードされるλまたはκの軽鎖をもっています。一般的に重鎖は標的特異性に関連しているが、軽鎖は自己反応性の防止とレセプター活性化の増強に関連しています。2種類の軽鎖の比率は生物種によって異なります。

VectorBuilderのpiggyBac抗体（重鎖＋軽鎖）共発現ベクターシステムは、哺乳動物細胞への抗体重鎖＋軽鎖共発現カセットの非ウイルス性、トランスポゾンベースのデリバリーを実現する非常に効率的なツールです。このシステムには2つのベクターが含まれており、いずれも大腸菌プラスミドとしてデザインされています。第一のベクターはヘルパーPBaseプラスミドと呼ばれ、トランスポゼースをコードしています。第二のベクターはpiggyBacトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、転移される抗体（重鎖＋軽鎖）共発現カセットを括る2つの末端反復（TR）を含んでいます。ヘルパーPBaseプラスミドとpiggyBacトランスポゾンプラスミドを標的細胞に共導入すると、ヘルパープラスミド由来のトランスポゼースがトランスポゾン上の2つのTRを認識し、フランキングされた抗体（重鎖＋軽鎖）共発現カセットを宿主ゲノムに挿入します。重鎖と軽鎖のコード領域はポリアデニル化シグナルで隔てられています。重鎖と軽鎖の転写はそれぞれ別々のプロモーターによって駆動されます。ベクターデザインをする際に、重鎖および軽鎖の可変領域をコードする配列をカスタマイズすることにより、お客様の個別のニーズを満たす抗原結合特異性を有するベクターを作製することができます。重鎖および軽鎖の定常領域は、当社の一般的な定常領域データベース（ヒトおよびマウスIgG1およびマウスIgG2aおよび2b重鎖を含み、ヒトおよびマウスκおよびヒトおよびマウスλ2およびマウスλ1軽鎖を含む）から選択するか、またはお客様独自の配列を入力して使用することができます。さらに、組換え抗体の分泌を増加させるために、シグナルペプチド(例： IL-2 sig)をベクターに添加することができます。

ヘルパーPBaseプラスミドとpiggyBacトランスポゾンプラスミドを標的細胞に共導入すると、ヘルパープラスミド由来のトランスポゼースがトランスポゾン上の2つのTRを認識し、フランキングされた抗体重鎖発現カセットを宿主ゲノムに挿入します。挿入は通常、組み込まれた断片の両サイドに重複するTTAA配列を含む宿主染色体部位で起こります。PiggyBacはクラスIIトランスポゾンであり、カット＆ペースト形式でコピーを残すことなくあちこちに転移します。（対照的に、クラスIトランスポゾンはコピー＆ペーストで転移します。） ヘルパープラスミドは宿主細胞に一時的にトランスフェクトされるだけなので、時間の経過とともに失われます。ヘルパープラスミドが失われると、抗体（重鎖＋軽鎖）をコードする遺伝子が宿主細胞のゲノムに永久に留まることになります。

当社のpiggyBac発現ベクターは、哺乳動物細胞におけるモノクローナル抗体重鎖および軽鎖を高効率にトランスフェクションし、高収量が得られるように最適化されています。可変型重鎖および軽鎖をコードする配列をカスタマイズしてベクターに組み込むことにより、標的抗原に対して高い親和性を有する抗体のご提供を可能にしています。

ベクターDNAの恒久的な組み込み：一般的なトランスフェクションでは、細胞への一過的なDNAの導入のため、ベクターDNAは時間とともに消失します。特に分裂速度の速い細胞では弱点となります。それに対し、piggyBacトランスポゾンベクターをトランスポゼースをコードするヘルパーベクターと共に細胞にトランスフェクトすると、piggyBacベクターのITR間にデザインされた遺伝子は宿主細胞のゲノムに恒久的に組み込まれます。

技術的に簡単：トランスフェクション法によるプラスミドベクターの導入は、ウイルス生体へのパッケージングを必要とするウイルスベクターよりも、はるかに簡単な技術で行うことができます。さらに、重鎖と軽鎖の両方のコード領域を単一のプラスミド上に搭載することで、トランスフェクションの手順がさらに簡略化されます。

再現性と大量生産：組換えタンパク質は、トランスフェクトされた宿主細胞から直接採取されます。したがって、異なるバッチの再現性は容易に達成できます。さらに、宿主細胞の増幅により、大規模な抗体生産が可能になります。

細胞タイプの制限： piggyBacベクターの細胞への導入はトランスフェクションに依存しますが、トランスフェクション効率は細胞タイプによって大きく異なります。非分裂細胞は分裂細胞よりも、また初代培養細胞はライン化（株化）された細胞よりも導入が困難です。さらに、神経細胞や膵臓β細胞などある種の細胞では、トランスフェクション法でのベクター導入は難しいことが知られています。また、プラスミドのトランスフェクションはin vitro実験に限定され、in vivo実験は一般的ではありません。これらの問題は、piggyBacシステムの使用を制限しています。

重鎖と軽鎖の最適な発現比率の設定が難しい： すべての抗体は重鎖と軽鎖から構成されています。抗体産生を成功させるには、重鎖と軽鎖の正確な発現比が必要です。重鎖と軽鎖のコード領域は1つのベクター上に存在するが、プロモーターオクルージョンなどのメカニズムにより、重鎖と軽鎖の最適な発現を保証することはできません。具体的には、下流プロモーター近傍に配置されたコード領域は、上流プロモーター近傍に配置されたコード領域よりも低いレベルで転写される可能性があります。

5' ITR:  5’末端逆向き反復配列（5' inverted terminal repeat）。piggyBacトランスポゼースが両末端のITRを認識し、ITRとITR間にデザインされたDNA領域を宿主ゲノムに挿入します。

Promoter: 目的遺伝子を発現させるためのプロモーターをここに配置します。

Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核細胞において翻訳開始を促進させるため、目的遺伝子ORFの開始コドン直前に配置します。

IL2-sig: ヒトインターロイキン2のシグナルペプチド。タンパク質の分泌を促進します。

Heavy Chain Variable Region (VH):  ウシ成長ホルモンポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させ、Pol II RNAポリメラーゼによって転写されたmRNAにポリＡを付加します。 

Heavy Chain Constant Region (CH): アイソタイプを決定する重鎖定常領域。

BGH pA: ウシ成長ホルモンポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させ、Pol II RNAポリメラーゼによって転写されたmRNAにポリＡを付加します。 

Light Chain Variable Region (VL): 抗原認識を司る軽鎖可変領域。

Light Chain Constant Region (CL): 軽鎖定常領域。

rBG pA:  ウサギ β-グロビンポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させ、Pol II RNAポリメラーゼによって転写されたmRNAにポリＡを付加します。 

Marker: 薬剤耐性遺伝子 (例：ネオマイシン耐性遺伝子)、可視化遺伝子(例：EGFP)、またはデュアルレポーター遺伝子(例：EGFP/Neoの共発現)などのマーカー遺伝子。マーカーによってベクター内の遺伝子導入の有無を薬剤選択または可視化にて選抜できます。

3’ ITR: 3' 末端逆向き反復配列。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。

Ampicillin:  アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。