1本鎖アデノ随伴ウィルスベクター（ssAAV）

アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus :AAV)発現ベクターはin vitro及びin vivoでの遺伝子導入に広く用いられています。AAVは多くの哺乳類細胞株への遺伝子導入が可能であり、アデノウィルスと異なり免疫原性が非常に低いため、モデル動物を使ったin vivo研究には病理的影響を殆ど考えずに使用できます。

AAVベクターは、まず大腸菌用のプラスミドDNAとして構築されます。このベクターには、5'側inverted terminal repeat (ITR)と3’側ITRに挟まれた配列に目的遺伝子をクローニングします。精製したこのプラスミドベクター（トランスファーベクター）は、ヘルパープラスミドと共に、ウイルス産生細胞（当社ではHEK293T細胞を使用）にトランスフェクトします。ヘルパープラスミドは、トランスファーベクターの、5'側inverted terminal repeat (ITR)と3’側ITRに挟まれた配列をウィルス粒子内にパッケージングする手助けをします。このようにして作製されたAAVベクターをターゲット細胞に感染させることで、目的遺伝子を形質導入します。

AAVウィルスをターゲット細胞に感染させるとウイルス内の１本鎖線状DNAゲノムが細胞に入り、宿主細胞のDNAポリメラーゼによって２本鎖DNAに変換され、核内でエピソーマルコンカテマーとなります。このコンカテマーは複製しないため、分裂しない細胞では長期間維持されますが、分裂する細胞では分裂ごとに希釈され、減少していきます。また、AAVゲノムの宿主細胞のゲノムへのインテグレーションは滅多に起きませんので、遺伝子治療などのゲノムへの影響が心配される場合に有用です。

AAVの最も大きな利点はバイオセーフティレベル１（BSL1）の実験室で扱えることです。これはAAVは、宿主細胞内で複製できないようにエンジニアリングされているため、ウイルスを扱うヒトにもし感染したとしても、めったに炎症が起こらないとされています。

AAVは多くの系統が同定されており、ウィルスの表面タンパク質（カプシドタンパク質）の抗原性の違い（血清型またはセロタイプ）により型が分類されています。血清型の違いにより、組織指向性（組織別感染効率）が異なります。AAVベクターをウィルス粒子にパッケージングする際はその組織指向性を考慮して使用するウィルスの血清型を選ぶ必要があります。クローニングの際、特異性に影響を与えないためにこの分野では一般的であるAAV2由来のITRが使用されています。パッケージング用のヘルパープラスミドにはRep/Capプラスミドがあり、AAV2由来の複製遺伝子と選択した血清型のカプシドタンパク質を含み、指向性を決定します。以下の表はAAV血清型と適した標的組織・細胞のリストです。 

ベクターシステムの詳細については、下記の文献をご参照ください。

ベクタービルダーのAAVベクターシステムは、大腸菌での高コピー数複製、生きたウイルスの高力価パッケージング、宿主細胞の効率的な形質導入、および高レベルの導入遺伝子発現を実現できるよう製造プロトコールを最適化しています。そのため、当社のAAVプラスミドベクターは、血清型として既知のキャプシッドを外套したウイルス粒子にパッケージした非常に高い形質導入効率をもち、かつ安全性に対するリスクが低いウイルスベクターです。  

安全性: AAVは研究利用されるウイルスの中で、最も安全なウイルスベクターシステムです。本質的に複製能を欠如しており、人への病原性は認められていません。

宿主細胞のゲノム破壊の低リスク: 宿主細胞へ導入されたアデノ随伴ウイルスベクターは、核内でエピソーマルDNAとしてとどまります。宿主ゲノムへの組み込まれないため、ヒトでの応用に望ましく、ゲノム破壊によって生じる発がんリスクを抑えることができます。

高いウイルスタイター: ベクタービルダーのssAAVベクターは、高タイターのパッケージングプロトコールを開発し使っています。そのため、ベクタービルダーのウイルス作製サービスでは、10^13 genome copy/ml（GC/ml）以上のタイターでウイルスを回収することができます。

広範な組織指向性: 適切な血清型にパッケージングされれば、ヒト、マウス、およびラットなどの一般的に使用される哺乳動物種の様々なタイプの細胞および組織に導入することができます。しかしながら、使用する血清型によっては、ある種の細胞への導入は難しいことが知られています。（以下のデメリットを参照ください。 ）

 in vitro と in vivoでの両方で使用が可能: AAVは主に生きた動物へ形質導入する場合に使用されますが、in vitroにも効率よく使用できます。

搭載ゲノムサイズが小さい: AAVはベクタービルダーのウイルスベクターの中で、搭載できるウイルスゲノムサイズが最小です。AAVが許容できるITR間の最大サイズは4.7kbのため、ユーザーが選択できる遺伝子やコンポーネントの合計サイズは~4.2 kbに制限されます。

全ての種類の細胞に遺伝子導入できるわけではない: 適切な血清型にパッケージングされれば、非分裂細胞を含め、様々なタイプの細胞への遺伝子導入が可能ですが、細胞によっては、いずれの血清型を使用しても遺伝子導入が難しい場合があります。

技術的な難しさ: AAVウイルスベクターの使用には、ウイルス産生細胞に複数のプラスミドDNAをトランスフェクトして、生きたウイルス粒子を作成さえ、精製し、ウイルスのタイターを測定するなど、形質導入までにこなさなければならない様々な作業があります。これらの作業は、一般的なプラスミドのトランスフェクション法に比べ、技術的に習熟するまでの期間や、さらに実際のウイルス作製日数も長くかかります。

5' ITR: 5’ inverted terminal repeat. 野生型ウイルスでは5’ITRと3’ITRは同じ配列で、ウイルスゲノム両端に反対の方向で配置されており、ウイルスゲノムの複製起点になります。

Promoter: 目的遺伝子を駆動するプロモーターをここに配置します。

Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核細胞において翻訳開始を促進させるため、目的遺伝子ORFの開始コドン直前に配置します。 

ORF: 目的遺伝子のOpen reading frameをここに配置します。

Regulatory element: ユーザー判断でここに ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントWoodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE)を挿入できます。 WPRE はウイルス産生細胞でのウイルスの安定性をエンハンスします。そのため、ウイルス粒子の高いタイターとトランスジーンの高い発現を可能にします。

BGH pA: ウシ成長ホルモンポリA付加シグナル。パッケージングにおいて、上流ORFの転写を終結させます。

3' ITR: 3’ inverted terminal repeat. 5’UTRの項目を参照下さい。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。