カスタムライブラリー受託構築サービス

ライブラリー構築の設計

標的遺伝子のリストもしくは特定のゲノム領域を標的としたgRNA、shRNA設計サポートが必要な場合、ベクタービルダー社が所有する最適化されたパイプラインと強力な計算リソースを使用した設計サポートを行います。研究目的に適したライブラリー用ベクターバックボーン(レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、piggyBac、標準的プラスミドベクターなど)を選択してください。2ベクターCRISPRライブラリーを構築する場合は、スクリーニング方法に適したCas9またはCas9バリアント発現ベクターの設計、作製も行います。

ライブラリー構築

ベクタービルダー社ではマイクロリアクターチップを利用して高品質かつ低エラーのgRNAとshRNAオリゴプールを作製します。次に最小限のPCRサイクル数でオリゴを増幅し、平均100倍以上の存在率になるようにベクターバックボーンに効率的にクローニングします。ライブラリープラスミドを保持する大腸菌群は培養され、対数増殖期でグリセロールストックにされます。ライブラリーに品質検査のために、プラスミドプールに対してシークエンス深度500カバレッジ以上の次世代シークエンス(NGS)が行われます。NGSデータ解析によって設計されたオリゴ配列すべてのプール内での正規化された存在量が算出されます。

既製プラスミドプールの増幅

ベクタービルダー社ではマイクロリアクターチップを利用して高品質かつ低エラーのgRNAとshRNAオリゴプールを作製します。次に最小限のPCRサイクル数でオリゴを増幅し、平均100倍以上の存在率になるようにベクターバックボーンに効率的にクローニングします。ライブラリープラスミドを保持する大腸菌群は培養され、対数増殖期でグリセロールストックにされます。ライブラリーに品質検査のために、プラスミドプールに対してシークエンス深度500カバレッジ以上の次世代シークエンス(NGS)が行われます。NGSデータ解析によって設計されたオリゴ配列すべてのプール内での正規化された存在量が算出されます。

ライブラリーのウイルスへのパッケージング

CRISPRおよびshRNAスクリーニングのためには、レンチウイルスやアデノ随伴ウイルスの感染を介したウイルストランスダクションによって細胞にライブラリーを導入する必要があります。ベクタービルダー社はタイター、純度、再現性を大幅に改善できるウイルスパッケージングプロトコル、独自の技術や試薬を開発しています。当社のパッケージングプロトコルはウイルスベクターシステムやクローニングサービスの最適化にも及びます。そのため、当社のサービスに満足され、当社のクローニングやウイルスパッケージングサービスを繰り返し利用されるお客様の数はどんどん増加しています。

スクリーニング後サンプルのデコンボリューション

ベクタービルダー社はCRISPRおよびshRNAスクリーニング後のサンプルを次世代シークエンス(NGS)にかけ、得られたヒットの同定をサポートします。スクリーニング後のサンプルから得られたゲノムDNAを郵送するだけで、当社がNGSライブラリー作製、次世代シークエンス、データ解析を遂行し、数週間後にはサンプル中のgRNAもしくはshRNAの正確なコピー数を報告します。Emailにて生データと解析データをダウンロードするためのFTPリンクを連絡します。データは当社のFTPサイトに3か月のあいだ無料で保持されます。長期保持を希望される場合はご連絡ください。