CRISPR/shRNAライブラリー構築

VectorBuilderでは大規模のスクリーニングを行うための、カスタムCRISPRやshRNAライブラリーの受託作製サービスを提供しています。VectorBuilderの受託ベクター構築に通常使っている信頼性の高いベクターからプール型ライブラリーの豊富な作成実績があります。プラスミドライブラリーは、プラスミドを形質転換した大腸菌の グリセロールストック(カルタヘナ法に基づく情報提供書類付き)、またはDNA、またはウイルス粒子(カルタヘナ法に基づく情報提供書類付き)など、顧客のニーズに幅広く対応しています。カスタム構築したライブラリーは、弊社で次世代シークエンス法によって検証されたものを納品するため、ユーザーはスクリーニングによって、どの遺伝子を単離したか効果的に結果を得ることができます。

プール型CRISPR/shRNAライブラリー作製サービスの見積もり依頼は?

ホームページの デザインリクエストを送る ボタンをクリックし、必要なライブラリー情報をサブミットしてください。VectorBuilderの研究者が、価格、納期、必要情報を含んだサービスプロポーサルを作成し、リンクをメールにてご連絡いたします。プロポーサルに満足されたら、サービスプロポーサルをショッピングカートに入れて、インストラクションに沿ってご注文ください。

プール型CRISPR/shRNA ライブラリーの種類と遺伝学的スクリーニングへの使用目的
プール型CRISPRライブラリー

プール型 CRISPR ライブラリーは、大規模またはゲノム単位での、遺伝子コーディング領域やノンコーディング領域の機能性スクリーニングに対して効果的なライブラリーです。このライブラリーを使うことで、目的のパスウェイ、疾病、薬剤処理に対する細胞のレスポンス、発生過程、遺伝子調節などに関わる機能をもつ領域のスクリーニングが行えます。 次の表にCRISPRを使った場合のスクリーニングの種類を比較しています。

スクリーニングの種類  メカニズム ターゲットとされる機能領域  アプリケーション
ノックアウト hCas9 または Cas9 ニッケースをターゲットサイトのDNAの切断に用います。DNAの切断部位の修復が行われる際、ランダム突然変異(欠失、挿入など)がターゲットサイトに導入されます。 主にコーデイング領域 主にコーデイング遺伝子の機能性スクリーニング

CRISPRa

(転写活性型)

転写活性化ドメイン(例えば VP64)を融合した酵素不活性型 Cas9 (dCas9) を使います。ターゲットサイト下の遺伝子転写が常に活性化された状態でスクリーニングを行います。 主にプロモーター領域と他のノンコーデイングな調節領域 コーデイング遺伝子の機能獲得型又はノンコーデイング領域の調節機能のスクリーニング

CRISPRi

(転写抑制型)

転写抑制ドメイン(例えば KRAB)を融合した酵素不活性型 Cas9 (dCas9)を使います。 ターゲットサイト下の遺伝子転写が常に抑制化された状態でスクリーニングを行います。 主にプロモーター領域と他のノンコーデイングな調節領域 コーデイング遺伝子の機能欠損型又はノンコーデイング領域の調節機能のスクリーニング

プール型CRISPRライブラリーは、1ベクターシステム、または、2ベクターシステムで構築します。1ベクターシステムでは、Cas9 (または変異型 Cas9 )はgRNAを1つのベクターに乗せ、同時に発現させます。2ベクターシステムでは、 Cas9 (または変異型Cas9)を乗せたベクターと、gRNAを乗せたベクターの2種類を構築します。2ベクターシステムの利点は、Cas9を安定に発現する細胞株を単利し、gRNA発現ベクターを導入できることです。対照的に、1ベクターシステムの利点は、co-transfectionやco-transductionを避けることができ、Cas9安定細胞株がなくともスクリーニングを行える点です。しかし、1ベクターシステムには用途に制限があることや、ウイルスパッケージングタイターが低くなる場合があることを念頭に置いてください。

shRNAライブラリー(プール型)

プール型shRNAライブラリーは哺乳類細胞で大規模又はゲノムワイドの機能欠損スクリーニングを行うための強力でコストパフォーマンスのよいツールです。CRISPRベースのノックアウトスクリーニングで認識されている欠点*はshRNAライブラリーでは避けることができます。(*CRISPRで生じる突然変異は、ノックアウト効果に細胞間のばらつきが大きい。)

shRNAライブラリー(プール型)は、ターゲット遺伝子に対して、一定のノックダウンの効果を得ることができます。VectorBuilderでは、カスタムのshRNAライブラリー(プール型)構築はもちろんのこと、ヒトそしてマウスをターゲットにした既製品としてのプール型shRNAライブラリーもご提供しています。ヒトとマウスについては、VectorBuilderでは、次の2種類のスケールでready-to-use レンチウイルスライブラリーを販売しています。

Whole ゲノムshRNA ライブラリー(~19,000 RefSeq genes)

エリート遺伝子shRNAライブラリー (最も頻繁にPubMed Centralで引用された約2,000遺伝子に対するshRNA)。

1遺伝子に対して、5-6 種類の異なったターゲットデザインし、shRNAベクターを構築しています。

ライブラリーは次世代シークエンシングと機能アッセイによって検証済です。

プール型shRNA ライブラリー(既成品)についてもっと情報を読む >>

カスタムライブラリー構築サービスの一覧
提供するサービス サービス内容のご説明 参考価格(税抜き) 参考納期
カスタムライブラリー作製ストラテジーのデザイン 無料 1-4 日*
カスタムCRISPR または shRNA ライブラリー(プール型)作製 gRNA/shRNAのアレイベースのオリゴ合成, gRNA/shRNAのベクターへのクローニング及び次世代シークエンシング(NGS)**によるプラスミドプールの検証を含みます。 ¥628,000より 6-8 週間
既存のプラスミドライブラリープールの増幅***

既存のプラスミドライブラリーをプラスミドプールとしてお持ちの場合(例えばAddgeneから入手したCRISPR プラスミドプール), VectorBuilderではウイルスにパッケージングいたします。 増幅のステップはウイルスパッケージングの為に十分なDNAを得ることが必要があります。プラスミドプールは平均100 x representation 以上になるように、大腸菌に形質転換して増幅します。増幅したプラスミドDNAを精製し、パッケージングに使います。

¥40,500より 10-16 日
プールしたライブラリーのウイルスパッケージング ウイルスパッケージングサービスに関しては、こちらをご覧ください here 
既存のプラスミドライブラリープールのNGSによる検証 VectorBuilderは増幅の前およびまたは後にNGSによって既存のプラスミドライブラリープールの品質を検証することができます。このサービスは、プラスミドプールからNGS ライブラリーの調製、イルミナシークエンシング(500回以上のカバレージ)そしてデーター解析が含まれます。 プラスミドプール当たり ¥62,500 より 3-5 週間
スクリーニングによって得られたサンプルのNGSデコンボリューション  スクリーニングされた細胞のゲノムDNAからのNGSライブラリーの調製、イルミナシークエンシング(500回以上のカバレージ)およびデーター解析が含まれます。 サンプル当たり¥62,500 より 3-5 週間
その他、カスタムライブラリー作製  お問い合わせください

* gRNA や shRNA のデザインが必要な場合、プロジェクトによって納期が変わります。
** デフォルト納品形態は大腸菌のグリセロールストックです。
*** ユーザー提供の既存プラスミドライブラリープールからの作製の場合、プラスミドライブラリーの品質やそれぞれのプラスミドの存在量の不均一性が最終のウイルスパッケージングの品質に大きく影響します。ユーザー提供プラスミドライブラリーの場合、弊社のタイター保証は適用されないことを御了承ください。

サービスの詳細
カスタムライブラリー構築のストラテジーをデザイン

もしgRNA又はshRNAのシークエンスをお持ちでない場合、VectorBuilderは最適化されたパイプラインと強力なコンピュターのリソースを使用して、ユーザーのターゲット遺伝子またはゲノム領域のgRNA又はshRNA プールのデザインを無料で行います。ユーザーの研究ニーズに応じて、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、piggyBac及びプラスミドなどのライブラリー構築には、ベクタービルダーで通常使用しているベクターバックボーンからの選択や、ユーザー提供のベクターバックボーンからのライブラリー構築を選択できます。2ベクターCRISPRライブラリーでは、ユーザーのスクリーニングストラテジーに適したCas9 又は変異型 Cas9 の発現ベクターをデザインし、ベクターとライブラリー構築も可能です。

カスタムCRISPR/shRNAライブラリー作製(プール型)

VectorBuilderは高品質で低エラー率のgRNA又はshRNAのオリゴプールを合成するために、チップベースのでオリゴを合成しています。オリゴは最低限のサイクルでPCR増幅し、ターゲットに対して平均100倍以上の representationを保持して、ベクターバックボーンにクローニングされています。構築されたCRISPR又はshRNA ベクターライブラリーは大腸菌に形質転換され、指数増殖期にグリセロールストックを作成しています。ライブラリーの品質の信頼度を評価には、NGSを行い、 gRNAまたはshRNA のプラスミドプールについて500倍以上のシークエンスカバーレージを保証することを確認しています。 NGSデータの解析からは、プール内での標準化された分布をもつ すべてのgRNAまたはshRNAが検出されることを確認します。

既製プラスミドプールの増幅

VectorBuilder は他のリソース(例えばAddgeneなど)からの既存のプラスミドライブラリーの増幅なども受託作成いたします。VectorBuilder は最初にプール型プラスミドを平均100倍以上の存在量(representation)になるよう、スーパーコンピテントセルに形質転換します。大腸菌は指数増殖期でグリセロールストックを作製し納品が可能です。

さらに大腸菌グリセロールストックから、関連サービスとして、ウイルスパッケージングもご提供しています。プラスミドDNAをエンドトキシンフリーのマキシプレップで精製し、ご依頼のウイルス粒子にパッケージングを行い、ウイルスを納品します。

VectorBuilder は実際の平均gRNA/shRNA fold representation を算出するためトランスフォーメイションののちコロニー数をカウントします。VectorBuilderは形質転換前と形質転換後にプラスミドプールのNGS検証を行い、fold representationを求めます。
VectorBuilder はコロニーをカウントすることで推定される100倍以上の平均representationを保証します。しかし、ユーザー提供の既存プラスミドライブラリープールからの作製の場合、既存プラスミドライブラリーの複雑性や均一性のばらつきにより、最終納品産物のrepresentationの100%保障が適用できないことをご了承ください。

プールされたライブラリーのウイルスパッケージング

CRISPR/shRNA スクリーニングでは、レンチウイルス またはアデノ随伴ウイルスなどのウイルスを介してプール型ライブラリーを細胞に導入する必要があるかもしれません。VectorBuilderはタイター、純度、生存率及び一貫性に関してウイルスパッケージングプロトコールを大幅に改善した独自の技術と試薬を開発しました。 当社のパッケージングプロトコールはクローニングサービスで使用されるウイルスべクターシステムにも最適化されています。VectorBuilderのクローニングやウイルスパッケージングサービスを一度ご利用いただいたユーザーの多くが、リピーターとなり、ユーザーの満足度が高いことが特徴です。
ウイルスパッケージングサービスについてもっと情報を読む>>

スクリーニング後に得られたサンプルのNGSデコンボリューション 

スクリーニング後に、どのような方法でNGSによってヒットを特定するか? そのような場合は、ポストスクリーニングゲノムDNAをVectorBuilder に送ってください。VectorBuilder は数週間でNGSライブラリー作成, ハイスループロットシークエンシングを行い、データ分析そしてgRNAまたはshRNAの正確なカウントデータをお届けします。NGSの完了は、メールでユーザーにご連絡します。未処理の NGSシークエンスデータと解析したデータは、リンク先のFTPサイトより、ユーザーのローカルサーバーにダウンロードしていただけます。VectorBuilderは、解析終了後、3ヶ月間、ユーザーデータをFTPサイトに無料で保存します。ご依頼によっては、データの3か月以上の長期保存も行います。

その他のカスタムライブラリー作製(ファージディスプレイ、two-hybridなど)

CRISPR/shRNA以外の大規模スクリーニングを行うカスタムベクターライブラリーが必要な場合、VectorBuilderにお問い合わせください。ファージディスプレイ、イーストtwo-hybrid、遺伝子発現ライブラリーなど、様々なご要望にお応えします。VectorBuilderのホームページの  デザインリクエストを送る にライブラリーの種類、スクリーニングのアイデアを書いてお問い合わせください。VectorBuilderの研究員が、2~3 日でサービスプロポーサルをご提出いたします。