LNPカプセル化

図3. in vitroにおける効率的なLNP-ｍRNA送達と遺伝子発現。LNPカプセル化EGFP mRNAあるいは市販のトランスフェクション試薬と混合したEGFP mRNAで細胞を処理した。(A）Jurkat細胞および293T細胞におけるEGFP発現のフローサイトメトリー結果。MFI：蛍光強度の中央値。（B）トランスフェクション後24時間のHEK293T細胞の蛍光像。

図4.  マウスにおけるルシフェラーゼ（Luc）mRNAの発現とmRNAによる免疫反応。(A) インジェクション後6時間、24時間、48時間のライブイメージングによりルシフェラーゼ活性を可視化した。(B）インジェクション後48時間の血清中で2種の炎症性サイトカイン、IL-6とTNF-⍺を定量。エラーバーは標準誤差を表す。マウスの系統： C57BL/6J；マウス年齢：8週；インジェクション方法：筋肉内注射。(C）ウイルス抗原A、ウイルス抗原B、またはコントロールPBSをコードする30ugのLNPカプセル化mRNAを筋肉内注射14日後のBalb/Cマウス由来の脾臓細胞のIFN-γ ELISpotアッセイ。

図5. プライマリーT細胞へのEGFP mRNAのトランスフェクション （A）トランスフェクション後24時間でフローサイトメトリーを用いて測定したEGFP発現細胞カウントのヒストグラム。プライマリーT細胞は、未処理（NC）、市販のトランスフェクション試薬でカプセル化したｍRNA、または脂質ナノ粒子でカプセル化したｍRNA（LNP）の3種類の処理群に分けた。（B）フローサイトメトリーで定量したそれぞれの群の蛍光強度中央値（黒）とEGFP陽性細胞の割合（％；グレー）。

図6. 抗CD31抗体結合ホタルルシフェラーゼ（FLuc）LNP-mRNAは肺におけるルシフェラーゼ発現の改善を示した。マウスの系統 C57BL/6J；マウス年齢：6-8週；マウス性別：雌；投与経路：尾静脈。ネガティブコントロール：IgG2a標識FLuc LNP-mRNA。

図 7. LNP製剤によるin vitroで効率的なプラスミドトランスフェクションを達成 （A）EGFPを強発現するプラスミド（pDNA-CMV>EGFP）をSM102またはAKC-0315 LNPを用いてカプセル化し、HEK293T細胞にトランスフェクションした。EGFP発現をトランスフェクションして24時間後に観察、撮影した。（B）最適化したSM102ベースのLNP製剤は流通している他のPEIトランスフェクション試薬と比較して、HEK293T細胞への導入効率は~6.6倍まで到達した。ホタルルシフェラーゼ発現プラスミドベクター（pDNA-CMV-Fluc）をレポーターとして使用した。

図 ８. ルシフェラーゼ発現プラスミドベクター（pDNA-CAG>Luc+）をVectorBuilderの新規LNP製剤でカプセル化し、体重当たり0.6 mg/kg で静脈注射した。ルシフェラーゼの発現は注入して96時間後まで観察された。