LNPカプセル化
ベクタービルダーは、高いカプセル化効率と均質性の高いLNPを実現する、RNAおよびプラスミド送達のための脂質ナノ粒子（LNP）カプセル化サービスを提供しています。LNP製剤の最適化によって送達効率を高めることや、特定組織を標的とする抗体をLNPに結合させて特定の組織を送達標的とすることも可能です。LNP-RNA治療薬の大規模製造についてはCDMOサービスをご覧ください。
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特長
- 標準処方（SM102、ALC-0315、MC3など）およびカスタム処方が可能
- mRNA、saRNA、siRNA、Cas9 mRNA/sgRNA mix、circRNA、pDNAなど、さまざまなタイプのRNA/DNA分子をカプセル化可能
- 高いカプセル化効率 (up to 100%)
- 低い多分散性指数(PDI) (<0.1)
- 抗体結合LNPが利用可能
詳細については 治療用IVT RNA開発 または、LNP-RNA製品 をご覧ください。
品質管理(QC)
ベクタービルダーはRNAおよびプラスミドのLNPカプセル化についての包括的なQCを提供しています。
| 属性 | QCアッセイ | リサーチグレード | GMP-like |
|---|---|---|---|
| 外観 | 目視確認 | √ | √ |
| 濃度 | RiboGreenアッセイ | √ | √ |
| カプセル化効率 | RiboGreenアッセイ | √ | √ |
| 粒子サイズ | 動的光散乱(Zetasizer) | √ | √ |
| 多分散性指数(PDI) | 動的光散乱(Zetasizer) | √ | √ |
| 表面電荷(ゼータ電位) | 動的光散乱(Zetasizer) | √ | √ |
| カプセル化RNA安定性 | キャピラリーゲル電気泳動(CGE) | オプション | √ |
| エンドトキシン | キネティッククロモジェニック(KCA) | オプション | √ |
| pH | pH紙 | オプション | √ |
| 無菌性 | バイオバーデン試験 | オプション | √ |
LNP-mRNA QCデータ
- TEM
- PDIとゼータ電位
- LNPの冷凍保存
図1. LNP-mRNAの Cryo-TEM写真。スケールバー=100 nm
図2. 粒子径およびゼータ電位分布解析。PDI（A）とゼータ電位（B）は、粒子の運動による変動光の強度差を測定するDLSによって測定された。LNP混合物が均一であることを示している。
図 3. 抗CD31抗体標識LNP-mRNAの長期凍結保存による影響（153日間）(A）ホタルルシフェラーゼ（FLuc）発現LNP-カプセル化mRNAを 無添加溶液／4℃、または7.5%スクロース溶液 ／-80℃の2通りの条件で保存した。両群の粒子サイズ（ピンク棒グラフ）とPDI（濃いシアンの点）を元のパラメーターと比較した。(B) 注入6時間後のFluc mRNA発現画像。ICRマウス（雌）に、PBS、無添加／4℃で保存したLNP、または7.5％スクロース溶液／-80℃で保存したLNPを静脈注射した。(C）凍結保存後のLNP-mRNAのカプセル化効率。作製後すぐのFLuc LNP-mRNAをコントロールとして用いた。(D）凍結保存後のRNAの完全性の比較。以上のデータより、抗体結合LNP-mRNAを7.5%スクロース溶液／-80℃で保存すると、粒子の均一性、カプセル化効率、mRNA発現が十分に維持され、長期保存が可能であることを示している。
LNP-RNA機能検証
- CAR-T細胞による細胞障害活性
- ヒトT細胞への
LNPトランスフェクション - LNP-mRNA発現 in vivo
- LNP-mRNA発現 in vitro
図4. VectorBuilderのLNP-mRNAを用いて作製されたヒトCAR-T細胞は、CD19陽性細胞に対して細胞傷害性を示した。(A) ヒトプライマリーT細胞に脂質ナノ粒子（LNP）でカプセル化した抗CD19 CAR mRNAをトランスフェクションした。CAR-T細胞の殺傷能力は、CD19陽性Raji細胞との共培養および放出される乳酸脱水素酵素（LDH）の測定により検証した。(B) 異なる共刺激ドメイン、4-1BB（CD19-BBz, 1949 nt）またはCD28（CD19-28z, 1931 nt）を持つ抗CD19 CARをコードする2種類のIVT mRNAをLNPにカプセル化した。(C) 活性化したヒトT細胞にそれぞれのLNP-mRNAをトランスフェクションし、CD19 CARの発現を確認した。(D) 様々なエフェクター細胞とターゲット細胞（E:T）比でCAR-T細胞とRaji細胞を18時間共培養し、LDHアッセイによりT細胞誘導性細胞傷害活性を測定した。
図5. EGFP LNP-mRNAを用いた高効率なヒトT細胞へのトランスフェクション。(A) 活性化T細胞にLNPカプセル化EGFP mRNAを1×10⁶細胞あたりmRNA 6 µg をトランスフェクションした。(B) LNPカプセル化前のEGFP mRNAの長さと質を変性アガロースゲル電気泳動により確認した。(C) トランスフェクション前にLNP粒子をゼータ電位分布解析にて検証した結果。(D) トランスフェクション後24時間で、EGFPの発現を蛍光顕微鏡の画像とフローサイトメトリーを用いて確認した。
図6. マウスにおけるルシフェラーゼ（Luc）mRNAの発現とmRNAによる免疫反応。(A) インジェクション後6時間、24時間、48時間のライブイメージングによりルシフェラーゼ活性を可視化した。(B）インジェクション後48時間の血清中で2種の炎症性サイトカイン、IL-6とTNF-⍺を定量。エラーバーは標準誤差を表す。マウスの系統： C57BL/6J；マウス年齢：8週；インジェクション方法：筋肉内注射。(C）ウイルス抗原A、ウイルス抗原B、またはコントロールPBSをコードする30ugのLNPカプセル化mRNAを筋肉内注射14日後のBalb/Cマウス由来の脾臓細胞のIFN-γ ELISpotアッセイ。
図7. in vitroにおける効率的なLNP-ｍRNA送達と遺伝子発現。LNPカプセル化EGFP mRNAあるいは市販のトランスフェクション試薬と混合したEGFP mRNAで細胞を処理した。(A）Jurkat細胞および293T細胞におけるEGFP発現のフローサイトメトリー結果。MFI：蛍光強度の中央値。（B）トランスフェクション後24時間のHEK293T細胞の蛍光像。
LNP最適化
- 抗体結合LNP
- 製剤の最適化
- 新規製剤
- 組織特異的LNP
図8. 抗CD31抗体結合ホタルルシフェラーゼ（FLuc）LNP-mRNAは肺におけるルシフェラーゼ発現の改善を示した。マウスの系統 C57BL/6J；マウス年齢：6-8週；マウス性別：雌；投与経路：尾静脈。ネガティブコントロール：IgG2a標識FLuc LNP-mRNA。
図 9. LNP製剤によるin vitroで効率的なプラスミドトランスフェクションを達成 （A）EGFPを強発現するプラスミド（pDNA-CMV>EGFP）をSM102またはAKC-0315 LNPを用いてカプセル化し、HEK293T細胞にトランスフェクションした。EGFP発現をトランスフェクションして24時間後に観察、撮影した。（B）最適化したSM102ベースのLNP製剤は流通している他のPEIトランスフェクション試薬と比較して、HEK293T細胞への導入効率は~6.6倍まで到達した。ホタルルシフェラーゼ発現プラスミドベクター（pDNA-CMV-Fluc）をレポーターとして使用した。
図 10. ルシフェラーゼ発現プラスミドベクター（pDNA-CAG>Luc+）をVectorBuilderの新規LNP製剤でカプセル化し、体重当たり0.6 mg/kg で静脈注射した。ルシフェラーゼの発現は注入して96時間後まで観察された。
図 11. 抗体結合脂質ナノ粒子（LNP）による組織特異的mRNA導入 (A) Cre依存性tdTomato発現カセットを持つAi9マウスに、抗CD31抗体結合Cre mRNA LNPまたは抗体結合無しのCre mRNA LNP を静脈注射した (0.4 mg/kg)。 (B) 投与72時間後の肺におけるtdTomato発現量の観察像。
リソース
主な引用論文
Phase Separation Enhanced PROTAC for Highly Efficient Protein Degradation
Yu, et al.
Biomacromolecules, 2024, doi: 10.1021/acs.biomac.4c00424
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Abstract: Biomacromolecular condensates formed via phase separation establish compartments for the enrichment of specific compositions, which is also used as a biological tool to enhance molecule condensation, thereby increasing the efficiency of biological processes. Proteolysis-targeting chimeras (PROTACs) have been developed as powerful tools for targeted protein degradation in cells, offering a promising approach for therapies for different diseases. Herein, we introduce an intrinsically disordered region in the PROTAC (denoted PSETAC), which led to the formation of droplets of target proteins in the cells and increased degradation efficiency compared with PROTAC without phase separation. Further, using a nucleus targeting intrinsically disordered domain, the PSETAC was able to target and degrade nuclear-located proteins. Finally, we demonstrated intracellular delivery of PSETAC using lipid nanoparticle-encapsulated mRNA (mRNA-LNP) for the degradation of the endogenous target protein. This study established the PSETAC mRNA-LNP method as a potentially translatable, safe therapeutic strategy for the development of clinical applications based on PROTAC.
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