pUASTB ショウジョウバエ用遺伝子発現ベクター(プロモーター選択可)

概要

当社のpUASTBベクターシステムは高効率なトランスジェニックハエの作製と導入した遺伝子の発現制御を実現します。当システムはP因子トランスポゾンシステムとφC31インテグラーゼシステムの両方が組み込まれているうえにGal4誘導型プロモーターによる強力な遺伝子発現制御を実現します。そのため、pUASTBベクターはP因子トランスポゾンとφC31インテグラーゼのどちらかを選択して使用することができます。どちらの場合でも、目的の遺伝子は2つのP因子TR(terminal repeat)の間にあるattBサイトの近傍にクローニングされます。

P因子トランスポゾンによるゲノム挿入を利用するなら、pUASTBとP因子トランスポゼースをもつヘルパープラスミドを宿主細胞もしくは胚に同時に導入します。ヘルパープラスミドから発現したトランスポゼースはpUSASTBの2つのP因子TRとそのあいだの領域を宿主ゲノムへ挿入します。遺伝子配列の挿入される配列に明確なバイアスはありません。

φC31インテグラーゼによるゲノム挿入に利用するならばpUASTBとφC31インテグラーゼをもつヘルパープラスミドをattPサイトをもつ宿主細胞もしくは胚に同時に導入します。φC31インテグラーゼはattPとattBのあいだで組み換えを起こしてpUASTBを宿主ゲノムへ挿入します。

pUASTBベクターのmini white遺伝子は目の色を決定し、遺伝子導入が成功したトランスジェニックハエの同定に使われます。

pUASTBベクターシステム(プロモーター選択可)は実験目的に応じて当社のショウジョウバエプロモーターデータベースから任意の遺伝子発現用プロモーターを選択できます。当社のデータベースからは次のようなプロモーターを選択できます。遍在的プロモーターとしてアクチン5C、ポリユビキチン、アルファ1チューブリン;組織特異的プロモーターとしてRh2(単眼特異的)、そして誘導型プロモーターとしてCu2+存在下で活性化するMtnプロモーターなどが選択できます。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Methods Mol Biol. 420:61 (2008) The use of P-element transposons to generate transgenic flies
Proc Natl Acad Sci U S A. 97:5995 (2000)
Proc Natl Acad Sci U S A. 95:5505 (1998)
Description of the φC31 integrase system
Proc Natl Acad Sci U S A. 104:3312 (2007) Use of pUASTattB and germ-line-specific φC31 integrase to construct transgenic Drosophila
Genetics. 166:1775 (2004) Use of pUASTB to construct transgenic Drosophila
Mol Cell Biol. 10:6172 (1990) Characterization of the Actin 5C promoter
Mol Cell Biol. 8:4727 (1988) Characterization of the Drosophila Polyubiquitin promoter
Nucleic Acids Res. 19:5037 (1991) Comparison of alpha 1-tubulin promoter with other Drosophila promoters
Genetics. 120:173 (1988) Analysis of the Rh2 promoter
Genetics. 112:493 (1986) Characterization of the Mtn promoter

特徴

当社のpUASTBショウジョウバエ遺伝子発現ベクターはP因子トランスポゼースもしくはφC31インテグラーゼのどちらかを利用した目的遺伝子のゲノム挿入と、Gal4による発現誘導を実現します。当社のベクターはE.coliでの高コピー数複製と高効率なトランスジェニックハエの作製が可能です。研究目的に応じて任意のプロモーター(遍在的、組織特異的、もしくは誘導型プロモーター)を選択できます。

メリット

配列特異的な挿入: φC31インテグラーゼはattPサイトで配列特異的な挿入を引き起こしますが、その他のゲノム配列への挿入は起こりません。そのため宿主の遺伝子を破壊したり、挿入部位の位置効果によって導入した遺伝子の発現が影響を受ける危険を減らすことができます。

高い柔軟性: 研究目的に応じて任意のプロモーター(遍在的、組織特異的、もしくは誘導型プロモーター)を選択できます。

高効率:φC31インテグラーゼをもちいた生殖細胞への遺伝子導入はP因子トランスポゾンを利用したpUASTシステムよりも高効率です。

デメリット

ランダムなゲノムへの挿入:  P因子トランスポゾンによるゲノム挿入を選択した場合、P因子のランダムなゲノムへの挿入は挿入場所の特定が難しく、挿入場所によっては導入された遺伝子の発現に影響を与えます。遺伝子の挿入が宿主遺伝子もしくは転写制御因子の配列に起こり、それらの機能を破壊する可能性もあります

技術的な煩雑さ: トランスジェニックハエの作製は胚へのインジェクションやハエの飼育・交配など、高い技術が要求されます。

attPサイトが必要:φC31インテグラーゼによるゲノム挿入を選択した場合、トランスジェニックハエの作製にはあらかじめattPサイトがゲノムに導入された特別な宿主株が必要です。

基本コンポーネント

P-element 3’ end: P因子の右TR(terminal repeat)もしくは3’TR。DNA配列がP因子5‘TRと3‘TRで挟まれている場合、Pトランスポゼースは両TRに挟まれている領域を宿主ゲノムに挿入する。

Promoter: 下流の遺伝子の発現させるためのプロモーターが配置される。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 目的遺伝子のORFをここに配置する。

SV40 terminator: SV40(Simian virus 40)のポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写停止を助ける。

attB site: バクテリオファージφC31インテグラーゼによって認識されるattBサイト。φC31インテグラーゼは宿主ゲノムにあらかじめ導入されているattPサイト特異的にpUASTBプラスミドを挿入する。

mini-white: ショウジョウバエのwhite遺伝子の派生型。ミニホワイト遺伝子は成体ショウジョウバエの目の色に関する優性マーカーであり、white遺伝子変異体をバックグラウンドとした遺伝子導入の成否の判断に使用する。

P-element 5’ end: P因子の左側TR(terminal repeat)もしくは5’TR。DNA配列がP因子5‘TRと3‘TRで挟まれている場合、Pトランスポゼースは両TRに挟まれている領域を宿主ゲノムに挿入する。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。