バーコードライブラリー構築サービス

技術情報

バーコード長と複雑性

ヌクレオチドでバーコードをデザインするには、DNA塩基にユニークな配列を割り当て、さまざまな情報を組み入れる必要があります。 始めに、短い塩基配列は特定の細胞の識別子のような基本情報を表現することができます。例えば、"ATCG "は細胞1を表し、"TAGC "は細胞2を表します。バーコードの長さが長くなるにつれて、コード化される情報の複雑さと多様性は指数関数的に増大していきます。バーコード配列が長いほど、より多くの異なる順列が利用可能になり、より多くのバリエーションを一意に識別できるようになります。

バーコードライブラリーの最大複雑度は、与えられたヌクレオチドで生成可能な組み合わせの数に基づいて計算できます。ランダム化されたヌクレオチドからなるバーコードの場合、各位置で4種の塩基が来る可能性があります。： 与えられたバーコードの長さ（N）に対する可能な組み合わせの総数（複雑さ）は4^Nです 。例えば、ランダム化されたNNNバーコードは64（4³）通りの組み合わせが可能になります。

バーコードベクターの設計

ベクターにバーコードを配置するためには、効果的にシークエンスできること、ライブラリーのクローニング、スクリーニング、デコンボリューション工程との互換性が確保できるように戦略的な考慮が必要です。レンチウイルスベクターの場合、バーコードはgRNAや可変領域などと一緒にウイルスベクターのゲノム挿入領域内に組み込まれ、宿主ゲノムへ挿入されることが必要です。また、mRNA転写領域内にバーコードを配置して、バーコードを読むことでmRNA転写産物を同定することも可能です。解析を容易にするため、バーコード配列はPCRで増幅可能な領域に配置される必要があります。さらに、バーコードのデザインはNGSでも検出できるように検討され、NGSによって正確な検出と定量が保証される必要があります。理想的には、バーコード配列はアーティファクトを避けるため、研究対象の生物学的プロセスに干渉しないことが望ましいが、これには多くの事前知識が必要となります。

バーコードと可変領域の対応を1対1にするか、多対1にするのかも重要な検討事項です。1対1のケースでは、単一のバーコード配列は特定の可変領域に対応しますので、単純かつ直接的な両者の紐づけが可能です。多対1のケースでは、複数のバーコードが同じ可変領域に対応することになります。この状況は大きな利点となり、特定の可変領域に対応する複数バーコードの検出をbiological replicateとして扱うことできるので、検出結果の統計的な信頼性を高めることができます。統計的信頼性の増加によって、ハイスループット実験におけるポジティブなシグナルとランダムな変動の区別とつけやすくなります。さらに、同じ可変領域に複数のバーコードを使用することでクローン解析が可能になります。これは腫瘍細胞のように均一性が低い細胞集団の研究に役立ちます。

バーコード導入とNGSによる読み出し

バーコードを細胞へ導入するためには、レンチウイルス、AAV、レトロウイルスなどのウイルスベクター、またはpiggyBacやSleeping Beautyのようなトランスポゾンベクターを使用します。ベクターシステムの選択は、標的細胞のタイプ、デリバリー効率、希望するバーコード発現期間などを考慮して決定してください。NGS解析用に細胞バーコードを単離する場合、バーコードをRNAから読み出すか、それともゲノムDNAから読み出すのかに応じて適切なベクターシステムを選ぶ必要があります。バーコードを細胞のゲノムDNAに恒久的に組み込むベクターシステムは、ゲノムDNAからの読出しに適しています。バーコードの位置は慎重に検討される必要があり、PCR増幅が可能で、NGSシークエンスができるように設定することが極めて重要です。一方、バーコードをRNAから読み出す場合は、バーコードが転写産物の一部として発現する必要があります。トランスクリプトームとバーコードの両方の情報を同時に取得するシングルセルRNAseq実験（Perturb-Seq、CROP-Seq）では、RNAからのバーコード読出しは実験デザイン上に必須となります。

実験データ

図1. 縮重ヌクレオチド戦略を用いたN(21)バーコードにおけるヌクレオチド分布。各位置におけるアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)の割合を示す。すべての位置でヌクレオチドが均等に分布している。