エンハンサー/プロモーターライブラリー構築サービス
ベクタービルダーは、遺伝子発現を調節するシス調節エレメントを機能的に評価するための高複雑性エンハンサー／プロモーターライブラリーの構築をお手伝いします。一般的に、エンハンサー／プロモーターライブラリー構築は、レポーター遺伝子の上流または下流にシス調節エレメントを配置し、エンハンサー／プロモーター活性のリードアウトとしてレポーター遺伝子の転写物をNGSによって測定します。
特長
- 要望に応じたデザイン: 研究目的に合致したエンハンサー/プロモーターライブラリーを構築するために様々なアプローチを提案。
- 高複雑性: 108クローンを超える複雑なエンハンサー/プロモーターライブラリーを作成可能。
- 最適化されたベクターデザイン：我々のベクターデザインは高いシグナル対ノイズ比を示し、エンハンサー／プロモータースクリーニングにおける一般的なボトルネックに対処可。
- 蛍光マーカー: 蛍光レポーターを組み込むことで、可視化と細胞選別の両方が容易になる。
- バーコード: バーコードを組み込むことで、上流の制御エレメントの転写活性のNGS解析が可能になる。
サービス詳細
価格と作業日数 プライスマッチ
| サービス | 概要 | 価格 (税別、送料別) | 作業日数 |
|---|---|---|---|
| エンハンサー／プロモーターライブラリーの設計 | 経験豊富なベクタービルダーのチームが高シグナル対ノイズ比を実現できる、希望通りの蛍光マーカーや多様なバーコードを組み込んだ検証済みライブラリーベクターを使用した、カスタムエンハンサー/プロモーターライブラリーを提案。 | 無料 | 1-4日 |
| プール型ライブラリーのクローニング | オリゴor遺伝子の配列合成、バーコードのライブラリーベクターへの大量並列クローニング、サンガーシーケンスによる予備検証、NGSによる検証を含む。納品物はライブラリーが導入された大腸菌グリセロールストックとNGSレポートが含まれる。 | 356,500円から | 5-8週 |
| プール型ライブラリーのウイルスパッケージング | ウイルスパッケージングサービスの詳細はこちらをご覧ください。ライブラリープラスミドのパッケージング価格は、通常のベクタープラスミドのパッケージング価格の1.5倍となります。 | ||
| スクリーニングサンプルのNGSデコンボリューション | スクリーニングから得られた細胞のゲノムDNAからのNGSライブラリーの作成、Illuminaシークエンス(500x以上のカバレッジ)およびデータ解析を含む。 | サンプル当たり65,100円から | 3-5週 |
技術情報
エンハンサー／プロモーターライブラリー構築ストラテジー
DNAチップによるオリゴ合成
DNAチップによるオリゴ合成は、様々なサイズや配列を持つエンハンサー/プロモーター変異体の作製に最適です。当社のオリゴ合成は、低いエラー率で通常300 ntまでのDNA配列の合成が可能です。
ゲノムDNAからの入手
エンハンサー／変異ライブラリーの可変断片は、プローブハイブリダイゼーションによってゲノムDNAまたはバクテリア人工染色体（BAC）から得ることができます。デザイン済みのプローブを用いて、ゲノム配列またはBACから潜在的な制御因子をキャプチャーし、濃縮します。さらに、バイアスが生じないショットガンタイプのアプローチを利用して、ゲノムDNAから潜在的な制御エレメントを得ることも可能です。キャプチャー後に、得られたDNAをライブラリーベクターにクローニングし、スクリーニングによってさらなる特性解析を行います。
既存の制御エレメントからの定性進化
エンハンサー／プロモーターライブラリーの構築は、既存の制御エレメント配列をベースにして行うことも可能です。Error-prone PCR法、縮重コドンの利用、DNAシャッフリングなど、様々な変異導入方法を用いることにより、新規変異体を作成します。これらの変異体をスクリーニングして求める性質を持つものを選別することで、制御エレメントの定性進化が可能になります。
基本コンポーネント
エンハンサーライブラリーのためのベクター設計
図1. エンハンサーライブラリーの主要なベクターコンポーネント
エンハンサー: スクリーニングするエンハンサー配列は、レポーター遺伝子の上流にも下流にも挿入できる。A）エンハンサーがレポーター遺伝子の下流、ポリ(A)シグナルの前にある場合、レポーター遺伝子と一緒に転写されるため、mRNA-seqで検出できる。B) レポーター遺伝子の上流に位置する場合、バーコード配列は一般的にレポーター遺伝子の3'UTR領域に組み込まれ、レポーター遺伝子と一緒に転写される。バーコードはエンハンサーの代わりとして機能し、mRNA-seqで配列決定される。
最小プロモーター: 任意の最小プロモーター配列が配置される。転写を活性化するエンハンサーエレメントが存在すれば、下流レポーターの転写を促進する。エンハンサーがない場合、ミニマムプロモーターはほとんど活性を持たない。
ポピュラーな最小プロモーターの詳細については、こちらをご覧ください
Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。
レポーター遺伝子: 視覚的に検出可能な蛍光タンパク質遺伝子（GFPなど）または化学発光タンパク質遺伝子（ルシフェラーゼなど）。エンハンサー活性の高感度検出を可能にする。
バーコード: エンハンサーライブラリーのバーコードは個々のプラスミドが持つユニークな短いDNA配列。スクリーニング後のNGS解析によって各バーコードのリード数が決定される。バーコード配列と特定のエンハンサーバリアントを相関させることにより、特定のエンハンサーの転写活性を同定することができる。
SV40 late pA: SV40（Simian virus 40）のlateポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。
プロモーターライブラリーのためのベクター設計
図2. プロモーターライブラリーの主要なベクターコンポーネント
プロモーター: スクリーニングするプロモーター配列をここに挿入して、レポーター遺伝子の転写を行う。
Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。
レポーター遺伝子: 視覚的に検出可能な蛍光タンパク質遺伝子（GFPなど）または化学発光タンパク質遺伝子（ルシフェラーゼなど）。プロモーター活性の高感度検出を可能にする。
バーコード: プロモーターライブラリーのバーコードは個々のプラスミドが持つユニークな短いDNA配列。スクリーニング後のNGS解析によって各バーコードのリード数が決定される。バーコード配列と特定のプロモーターバリアントを相関させることにより、特定のプロモーターの転写活性を同定することができる。
SV40 late pA: SV40（Simian virus 40）のlateポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。
実験データ
図3. 錐体細胞特異的プロモーターライブラリーの構築とスクリーニング。(A) 実験の流れ。既知の視細胞特異的プロモーターから新規変異プロモーターを作製して、AAVバックボーンにクローニングし、GFPを発現させた。AAVプロモーターライブラリーはマウスの網膜下領域に注入され、スクリーニングと解析が行われた。(B）ライブラリーの網膜下発現パターン。GFP発現AAVプロモーターライブラリーを、tdTomatoを発現するProA1プロモーターを持つ別のAAVと同時インジェクションした。ProA1は既知の錐体細胞特異的プロモーターである。赤色蛍光と緑色蛍光の共局在は、プロモーターライブラリー中に錐体特異的プロモーターが存在することを示す。
注文方法
お客様提供のプール型プラスミドライブラリー
お客様によって作製されたライブラリーDNAを使用する場合は、マテリアル提出ガイドラインにしたがってライブラリーDNAを郵送してください。作業遅延やライブラリーのダメージを避けるために、当社のガイドラインに忠実に従った梱包をお願いいたします。お客様から提供されたすべてのマテリアルは、必ずベクタービルダーによる品質検査を受ける必要があり、マテリアル当たり16,000円の検査費用が発生します。マテリアルが品質検査を通過しないとライブラリー構築が開始できないことをご承知おきください。お客様によって作製されたプラスミドライブラリーからライブラリー構築をする場合、当社で最終的なライブラリーの複雑性と均一性の保証はいたしかねます。