ゼブラフィッシュgRNA発現Tol2ベクター

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9)システムは様々な生物種でin vitroおよびin vivo遺伝子機能破壊を行うことできます。このゲノム編集システムでは、Cas9はガイドRNA（gRNA）と複合体を形成し、ゲノム内の相補的な18-22 ntの標的配列と直接相互作用することによって特異的なターゲッティングを実現します。Cas9はgRNAに相補的な配列につづいてプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）NGGを持つゲノム配列を切断します。切断された2本鎖DNAは相同組換え、または非相同末端結合によって修復された結果、様々な長さのインデル（ゲノム中の塩基の挿入または欠失）が生じます。

ゼブラフィッシュでCRISPR/Cas9遺伝子編集を行うためには、All-in-oneベクター（Cas9-gRNA共発現ベクター）または個別のCas9およびgRNA発現ベクターを細胞に導入することで、ノックアウト株を作製できます。もしくは、gRNAとCas9 in vitro transcribed (IVT) mRNAを1細胞期胚に直接注入する方法もあります。

Tol2技術はトランスポゼースを利用して、標的遺伝子をゼブラフィッシュ胚ゲノムにランダムな部位に挿入することで、トランスジェニック・ゼブラフィッシュを作製します。Tol2はクラスIIトランスポゾンであり、カット＆ペースト様式（転移後に自身のコピーを残さない）で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー＆ペースト様式をとります。Tol2トランスポゾンによる挿入サイトの両脇には８bpのダイレクトリピートが作り出されます。

CRISPR/Cas9システムとTol2技術の組み合わせによって、Cas9およびgRNAの永続的な発現が可能となり、遺伝子ノックアウト効率を上昇させます。ゼブラフィッシュの遺伝子編集を可能にするために、ベクタービルダーは3つの重要な特徴を持つTol2ベクターを開発しました:(1)Tol2トランスポゼースが認識する、転移される領域の両端に配置された2つの末端反復(ITR)；(2) gRNAを発現するユビキタスなゼブラフィッシュU6-3プロモーター；(3) トランスジェニック・ゼブラフィッシュの選別を容易にするため、心臓特異的プロモーターcmlc2の制御下にEGFPを配置。このベクターとTol2トランスポゼースを発現するヘルパープラスミド（またはトランスポゼースIVT mRNA）およびCas9を発現するベクター（またはCas9 IVT mRNA）を受精卵に共注入することにより、標的遺伝子がノックアウトされた安定ゼブラフィッシュ系統を作製できます。

このベクターシステムについての詳細は以下の論文をご参照ください。

このベクターとTol2トランスポゼース発現ベクターとCas9発現ベクターを同時トランスフェクションすることで、安定したゼブラフィッシュ遺伝子の変異株を作製できます。

簡便さ: ウイルスベクター作製やウイルス製造などは手間がかかるために、研究室によっては遺伝子導入システムを確立することが困難です。一方で、プラスミドを受精卵にインジェクションすることは技術的に簡便です。

恒久的なベクターDNAの挿入: 従来の形質転換法では宿主細胞へのDNAの導入はDNAの時間経過による減少のために一過的なものでした。この問題は増殖の速い細胞では特に顕著になります。一方で、Tol2トランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミド（もしくはTol2 mRNA）による形質転換法は遺伝子を宿主細胞へ恒久的に導入できます。Tol2を介した遺伝子導入は、ゼブラフィッシュでは遺伝子サイレンシングの影響を受けない可能性がある。従来のトランスフェクション法、もしくはエレクトロポレーション法に依る遺伝子導入は、宿主細胞へのDNAの導入はDNAの時間経過による減少のために一過的なものでした。一方で、Tol2ベクターとヘルパープラスミド（もしくはTol2 mRNA）の受精卵へのインジェクション形質転換法は、肺発生初期の多くの細胞でベクターのゲノムへの恒久的な挿入が起こります。Tol2トランスポゼースタンパク質の分解が進むにつれて、Tol2挿入は安定化し、挿入されたベクターは娘細胞へと引き継がれます。

遺伝子破壊のモニターが簡単に: このgRNA発現ベクターは、心臓特異的プロモーターcmlc2下流にEGFPが組み込まれています。心臓特異的に蛍光マーカーが発現することによって選別が容易になります。

オフターゲットの可能性: 標準的なCRISPRと同様に、オフターゲットが起こる可能性があります。このデメリットは、Cas9とgRNAの安定発現が両アリルの遺伝子を破壊できる可能性を高めるメリットとのトレードオフとなります。

PAMが必要：CRISPR/Cas9システムはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。

5’ ITR: Tol2 5' inverted terminal repeats。Tol2トランスポゼースは2つのITRを認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

cmlc2: 心筋ミオシン軽鎖2プロモーター。ゼブラフィッシュの心臓特異的プロモーターで、心臓における遺伝子の発現を強力に促進する。

EGFP: 緑色蛍光タンパク質; クラゲ（Aequorea victoria）由来のGFPのコドンが最適化されている。

SV40 early PA: SV40（Simian virus 40）のlateポリアデニレーションシグナル。Pol ll RNAポリメラーゼによって合成されたmRNAの転写停止を助ける。

U6-3: ゼブラフィッシュU6 small RNAプロモーター。低分子RNAを強力に発現する。

Terminator: Pol lll転写ターミネーター。Pol lll RNAポリメラーゼによって転写されたsmall RNAの転写を停止する。

3’ ITR: 3’ inverted terminal repeat.

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。