線虫Cas9 発現ベクター

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9)システムは様々な生物種でin vitroおよびin vivo遺伝子機能破壊を行うことできます。このゲノム編集システムでは、Cas9はガイドRNA（gRNA）と複合体を形成し、ゲノム内の相補的な18-22 ntの標的配列と直接相互作用することによって特異的なターゲッティングを実現します。Cas9はgRNAに相補的な配列につづいてプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）NGGを持つゲノム配列を切断します。切断された2本鎖DNAは相同組換え、または非相同末端結合によって修復された結果、様々な長さのインデル（ゲノム中の塩基の挿入または欠失）が生じます。

線虫（C. elegans）にCRISPR/Cas9遺伝子編集を行うためには、All-in-oneベクター（Cas9-gRNA共発現ベクター）または個別のCas9およびgRNA発現ベクターを細胞に導入することで、ノックアウト株を作製できます。ベクタービルダーのCas9発現ベクターはCas9上流に発現量を増加させる人工イントロンをもち、転写停止のために線虫の３‘UTRとポリアデニレーションシグナルを搭載します。Cas9発現用プロモーターはユビキタス（ft-3、pie-1）、組織特異的（spe-11、myo-2、myo-3、rab-3）、誘導性プロモーター（hsp16-2、hsp16-48）もしくは任意のプロモーター配列を使用できます。

Cas9発現ベクターはgRNA発現ベクターとともに線虫の生殖腺の遠位に注入することによって、生殖細胞の核に導入されます。変異が導入された子孫を選別することで目的の遺伝子ノックアウト株を得ることができます。別の方法として、Cas9発現ベクターのみをインジェクションして、Cas9安定発現株を作り出すことも可能です。

このベクターシステムについての詳細は以下の論文をご参照ください。

弊社のプラスミドCas9ベクターは、大腸菌での高コピー数と高効率トランスフェクションのために最適化されています。このベクターは、gRNA発現ベクターと使用することで線虫の効率的なゲノム編集を実現するように最適化されています。

簡便さ: ウイルスベクター作製やウイルス製造などは高い技術が必要となりますが、プラスミドのインジェクションは技術的に簡便です。

高レベル発現：イントロンを持つ合成プロモーターがベクターバックボーンに組み込まれ、ベクターに搭載された遺伝子の高レベル発現を実現している。

遺伝子導入の不均一性： 高コピーの遺伝子を導入できるが、導入コピー数にばらつきが出やすい。ある細胞では多くのコピーが導入されるが、他の細胞では少数コピーのみが導入されたり、全く導入されない場合もある。

PAMが必要：CRISPR/Cas9システムはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。

Promoter: 遺伝子発現用プロモーター。

Synthetic intron: 遺伝子発現を活性化するためにプロモーター近位に配置。

Kozak: Kozak配列。真核生物では翻訳開始を促進すると考えられており、目的ORFの開始コドンの直前に配置される。

ORF: T線虫のコドンに最適化されたCas9（CeCas9）。

unc-54 3’ UTR+polyA: 線虫由来Myosin-4 3' UTRと下流polyAシグナル配列。Pol II RNAポリメラーゼによって転写されたmRNAの転写停止とポリアデニル化に必要。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。