Tol2 non-coding RNA発現ベクター

Tol2 non-coding RNA発現ベクターは哺乳類動物細胞ゲノムにnon-coding RNA発現カセットを挿入、恒久的に発現させることができます。Non-coding RNAは多種のshort（30塩基以下）もしくはlong（200塩基以上）機能性RNA分子を含みます。micro RNAs (miRNAs)、small interfering RNAs (siRNAs)、piwi-interacting RNAs (piRNAs)、small nuclear RNAs (snRNAs)、small nucleolar RNAs (snoRNAs)、large intergenic non-coding RNAs (lincRNAs)、intronic long non-coding RNAs (intronic lncRNAs)、natural antisense transcripts (NATs)、enhancer RNAs (eRNAs) 、 promoter-associated RNAs (PARs)などの機能性RNAがあります。これらはタンパク質に翻訳されることはありませんが、DNA複製、エピジェネティック制御、転写および転写後制御そして翻訳制御など数多くの細胞内機構で重要な役割を担っています。

Tol2 non-coding RNA発現ベクターはRNAポリメラーゼⅡプロモーターを使用してnon-coding RNAを発現するように設計されているので、組織特異的、誘導性もしくは様々な活性強度を持つプロモーターを使用した多様な実験用途に対応できます。RNAポリメラーゼⅡプロモーターによる転写反応はプロモーターの3‘域から始まり、ポリAシグナル配列内で終了します。そのため、当ベクターから生産されるnon-coding RNAとオリジナルのnon-coding RNAの配列は正確に一致せず、上流と下流にいくつかの配列が追加されます。

当システムはE.coliプラスミドとして設計された2つのベクターから構成されます。ひとつめはヘルパープラスミドと呼ばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、２つのITR（inverted terminal repeats）のあいだに挿入予定DNA配列が組み込まれます。non-coding RNAと上流のプロモーターはITRのあいだにクローニングされます。

ヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドが標的細胞に同時導入されると、ヘルパープラスミドから発現したトランスポゼースはトランスポゾンプラスミド上の2つのITRを認識してITRとnon-coding RNA発現カセットを宿主ゲノムへ挿入します。piggyBacトランスポゾンはTTAA配列に挿入されるのに対してTol2トランスポゾンには特定の標的配列バイアスはありません。

Tol2はクラスIIトランスポゾンであり、カット＆ペースト様式（転移後に自身のコピーを残さない）で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー＆ペースト様式をとります。Tol2トランスポゼースによってTol2が挿入された配列の両端には8bpの重複配列がつくりだされます。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

Tol2 non-coding RNA発現ベクターとヘルパープラスミドはE.coliでの高コピー数複製、広範な標的細胞へ高効率なベクター導入および高いnon-coding RNA発現レベルを可能にします。

恒久的なゲノムへの挿入：従来方法で宿主細胞へ導入されたnon-coding RNAは時間経過とともに失われてしまいます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。一方でTol2トランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミド（もしくはTol2 mRNA注入）を使った遺伝子導入法はnon-coding RNA発現カセットを恒久的に宿主ゲノムへ挿入します。

簡便さ：パッケージングなどが必要なウイルスによる遺伝子導入と比べて、従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法は簡便です。

大きなサイズDNAが許容可能:Tol2トランスポゾンベクターはおよそ11kbのDNA配列を組み込むことができます。プラスミドのバックボーンとトランスポゾン関連配列は3kbほどしかないので、残りを任意の目的で使用することができます。

細胞タイプが限定される：Tol2ベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。非増殖細胞は一般的に増殖細胞よりも効率が悪く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。プラスミドによる遺伝子導入はin vitro用途に限定され、in vivo用途にはほとんど使用されません。これはTol2システムにも当てはまります。

5' ITR: Tol2 5' terminal repeat. Tol2トランスポゼースは2つのITR（5' ITR と3' ITR ）を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

Promoter: non-coding RNAを発現するプロモーター。

Non-coding RNA: 実験に使用するnon-coding RNA。

SV40 late pA: SV40（Simian virus 40）のlateポリアデニレーションシグナル。non-coding RNAの転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。