Tol2 CAR (キメラ抗原受容体)発現ベクター

Utilizing chimeric antigen receptor (CAR) vectors to produce engineered T cells (also 将来性のあるガン治療法として、キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR）を利用して腫瘍関連抗原を認識するT細胞（CAR-T細胞）を作製する方法が注目されています。CAR-T細胞療法は患者本人から採取されたT細胞（自家的）もしくは健康なドナーから採取されたT細胞（同種的）にCARを発現させ、抗原への結合によって腫瘍細胞を標的としてT細胞が活性化するように設計します。

CARは4コンポーネントから構成されています。1) 細胞外抗原認識ドメイン。特異性が確認されているモノクローナル抗体由来の単鎖可変領域フラグメント（scFv）から構成される。scFvは抗原特異的モノクローナル抗体の可変領域の軽鎖と重鎖がリンカーペプチドで連結された構造をしている。2) 細胞外ヒンジ。scFVを膜貫通ドメインに連結してCARの安定性と柔軟性をもたらす。3) 膜貫通ドメイン。CARを細胞膜につなぎ留め、抗原結合ドメインと細胞内シグナルドメインの橋渡しをする。受容体の発現と安定性を高めるために重要な役割を果たす。4) 細胞内シグナルドメイン。T細胞受容体（TCR）のCD3-zetaドメイン由来でありITAMs(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)を内包している。ITAMsは抗原への結合とともにリン酸化されて下流シグナル伝達系を活性化してT細胞を活性化します。さらに細胞内シグナルドメインに複数の（CD28、CD137由来の）共刺激ドメインを加えることで、T細胞の増殖性と持続性を上昇させることができます。

CARは過去数年にわたる細胞内シグナルドメインの改良によって進化しています。第一世代CARはCD3-zeta シグナルドメインだけを持っていました。第一世代CARを発現するT細胞は活性化できるものの、細胞毒性と増殖率が低いためにin vivoでの抗腫瘍活性が貧弱でした。続いてCD3-zetaシグナルドメインに加えて共刺激ドメインを付加した第二世代CARの出現によって、CAR‐T細胞のin vivo増殖性、拡張性および持続性の大幅な改善をもたらしました。CD3-zetaドメインに加えて2つのシス共刺激ドメインを細胞内シグナルドメインに付加した第三世代CARは抗腫瘍活性をさらに改善しました。第二世代CARを基に開発された第四世代CARは恒常的もしくは誘導的にサイトカイン発現する様に改良した細胞内シグナルドメインをもちます。同様に第二世代CARを基に開発された第五および最新世代CARはサイトカイン受容体の細胞内シグナルドメインを組み込んでいます。

当社のTol2 CAR発現ベクターはトランスポゾンシステムを利用して第二世代CAR発現カセットをT細胞に効果的に導入できます。Tol2トランスポゾンはメダカ(Oryzias latipes)から単離され、脊椎動物種ゲノムに広く見つかる非自律的トランスポゾンのhATファミリーに関連性を持ちます。

Tol2システムはは2つのベクターから構成されます。ひとつめはヘルパープラスミドと呼ばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、２つのITR（inverted terminal repeats）のあいだに挿入予定DNA配列が組み込まれます。CAR発現カセット（scFV領域、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内CD3 zetaシグナルドメインと共刺激ドメインを含む）はITRのあいだにクローニングされます。トランスポゼースとトランスポゾンプラスミドが目的細胞に同時にデリバリーされると、配列挿入の際にTol2トランスポゼースは配列挿入サイトの両端に相同な8塩基長の反復配列を生み出します。その他のトランスポゾンシステムとは異なり、配列挿入箇所に特段のバイアスはありません。piggyBacトランスポゾンを例にすると、TTAA配列を含む部位が挿入の標的となります。Creの存在下でCre-LoxPによる遺伝子配列の反転により遺伝子発現が活性化されます。トランスポゼースは、1）一過的なヘルパープラスミドのトランスフェクションもしくは、２）IVT (in vitro transcribed) mRNAを目的細胞へマイクロインジェクションする、2通りの方法でトランスポゾンを目的細胞にデリバリーできます。どちらの方法でも、トランスポゼースは短い間のみ発現します。ヘルパープラスミドの消失もしくはTol2トランスポゼースmRNAの分解によってゲノムに挿入されたトランスポゾンは安定化します。

Tol2は、カット＆ペースト型のクラスIIトランスポゾンに分類され、自己コピーを残さずに転移します（クラスIトランスポゾンは、コピー＆ペースト型で、自己コピーを残して転移します）。Tol2ヘルパープラスミドを再び導入することにより、ゲノムに痕跡を残すことなくTol2トランスポゾンを取り除くことができます。その際には痕跡を残さない場合と、欠失が生じる場合があります。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

Tol2 CAR発現ベクターは第二世代CARを発現します。Tol2プラスミドとヘルパープラスミドはE.coliでの高コピー数複製、広範な標的細胞へ高効率なベクター導入および高い発現レベルを実現します。

恒久的なゲノムへの挿入：Tol2 CAR発現ベクターはT細胞ゲノムにCAR発現カセットを恒久的に挿入し、長期間にわたるCAR発現を可能にします。

簡便さ： Tol2 CAR発現ベクターはT細胞への導入に簡便なエレクトロポレーション法を使用します。一方で、ウイルスベクターはT細胞への導入前にパッケージング操作が必要なために技術の習熟と時間がかかります。

低コスト: 臨床グレードのTol2ベクターの作成コストはウイルスベクターのコストと比べて非常に安くなるので、Tol2を使ったCAR-T細胞の臨床開発はより高い費用対効果が得られます。CAR-T細胞治療の臨床効果をマウスモデルによる前臨床試験では予期することはできず、臨床試験で決定されるべきなので、CAR-T細胞治療の開発に大幅な利点となります

エレクトロポレーション法の弊害：Tol2　CAR発現ベクターはエレクトロポレーション法によってT細胞に導入されます。CAR発現カセットが挿入された細胞が得られる効率は低～中程度となります。エレクトロポレーション法はT細胞にダメージを与え、機能的なCAR-T細胞の獲得数が減少させます。それゆえ、必要数をそろえるためにT細胞を長期間ex vivo培養する必要があり、時間経過とともに細胞の長期記憶が消失して表現型が変化する危険性があります。

5' ITR: Tol2 5' terminal repeat。Tol2トランスポゼースは2つのITR（5' ITR と3' ITR ）を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

Promoter: CARを発現するプロモーター。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

CD8-leader: T細胞表面の糖タンパク質CD8 alphaドメインのシグナルペプチド。タンパク質のT細胞表面への輸送と局在に必要。

scFv: 特異性が確認されているモノクローナル抗体由来の単鎖可変領域フラグメント。抗原特異性にしたがって細胞を認識する。

Hinge: CARの細胞外ヒンジ領域。scFVと膜貫通ドメインを連結して、CARタンパク質発現と機能の安定性と柔軟性をもたらす。

Transmembrane domain: CARの膜貫通ドメイン。CARを細胞膜につなぎ留め、抗原結合ドメインと細胞内シグナルドメインの橋渡しをする。受容体の発現と安定性を高める。

Costimulatory domain: CARの共刺激ドメイン。CAR-T細胞の生存率、増殖率および活性化状態の持続性を上昇させる。

CD3zeta: T細胞受容体のCD3ζ鎖。T細胞による免疫反応を活性化する。

SV40 late pA: SV40（Simian virus 40）のlateポリアデニレーションシグナル。CARの転写を停止する。

3' ITR: Tol2 3' terminal repeat.

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。