Tol2遺伝子発現ベクター

ベクタービルダーがカスタム構築するTol2ベクターシステムは、哺乳類細胞のゲノムに、デザインした外来DNAを効率的に組み込むことができます。このシステムはウイルスを使った遺伝子導入に比べて技術的に簡単で、プラスミドDNAのトランスフェクション方法で目的細胞のゲノムDNAに発現させたい目的遺伝子を恒久的に組み込むことができます。

本システムは、メダカ（Oryzias latipes）から単離されたTol2トランスポゾンに由来しています。シークエンスの相同性より、Tol2トランスポゾンは脊椎動物ゲノム全般に見られる非自立性エレメントのhATファミリー近縁であることが明らかになっています。

Tol2システムは2種類のプラスミドベクターから成り、ともに大腸菌で遺伝子改変が可能になっています。一方のプラスミドベクターは、トランスポゼースをコードする遺伝子をもつヘルパープラスミドです。他方のプラスミドベクターは、トランスポゾンベクターで、宿主細胞のゲノムDNAに転移させる目的遺伝子を含むフラグメントを、Tol2の terminal repeats (TRs) で挟んだデザインになっています。

ヘルパープラスミドとカスタムデザインしたトランスポゾンプラスミドを標的細胞にコトランスフェクトすると、ヘルパープラスミドから産生されたトランスポゼースがトランスポゾンプラスミド上の両末端のTRを認識し、宿主ゲノム中にTRと目的遺伝子を含む領域を組み込みます。組み込みは認識配列などのバイアスがなく生じ、TTAA配列を特異的なターゲットシークエンスとして使うpiggyBacなどとは異なり、挿入部位を選びません。

Tol2はカット＆ペースト型のクラスIIトランスポゾンに分類され、自己コピーを残さずに転移します（クラスIトランスポゾンは、コピー＆ペースト型で、自己コピーを残して転移します）。カット＆ペーストにより挿入されたTol2トランスポゾンは、シングルコピーで組み込まれ、各挿入部位で8bpの重複を生じます。そのため、宿主ゲノムのTol2トランスポゾン挿入部位に8bpのダイレクトリピートが作出されます。 

標的細胞にトランスポゼースを導入するには2つの方法があります。1つはヘルパープラスミドを細胞にトランスフェクトする方法で、この場合トランスポゼースの一過的発現が生じます。他方ははヘルパープラスミドからin vitro転写で合成したトランスポゼース mRNAを細胞に直接インジェクションする方法です。いずれの方法も、ヘルパープラスミドの消失およびトランスポゼースmRNAの分解により、トランスポゼースは短時間でしか発現されません。これにより、トランスポゾンの宿主ゲノムへの挿入が恒久的になります。Tol2トランスポゼースを再び導入すると、宿主ゲノムからトランスポゾンを取り除くことができます。

本ベクターシステムの詳細については、以下の文献をご参照下さい。

ベクタービルダーのTol2 トランスポゾンベクターシステムでは、11kbまでの配列を標的細胞のゲノムに挿入することができます。トランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドは、共に高コピー数プラスミドDNAとしてデザインされ、大腸菌での大量増幅が可能です。また、幅広い細胞種にトランスフェクションが可能で、遺伝子発現ベクター内にデザインされた遺伝子の高い発現レベルを維持します。

ベクターDNAの恒久的な組み込み: 一般的なトランスフェクションでは、細胞への一過的なDNAの導入のため、ベクターDNAは時間とともに消失します。特に分裂速度の速い細胞では弱点となります。反対にTol2トランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミド（あるいはTol2 mRNAの導入）を細胞に共トランスフェクションすると、Tol2トランスポゾンベクターのITR間にデザインされた遺伝子は宿主細胞のゲノムに組み込まれます。そのため宿主細胞に恒久的な遺伝子導入を行うことが可能です。

技術的に簡単: トランスフェクション法によるプラスミドベクターの導入は、ウイルス生体へのパッケージングを必要とするウイルスベクターよりも、はるかに簡単な技術で行うことができます。

カーゴサイズが非常に大きい: ベクタービルダーのTol2トランスポゾンベクターは～11kbのDNAを搭載することができます。ベクターバックボーン領域とトランスポゾン関連配列の3kbを差し引いても、目的遺伝子の挿入には十分なスペースが用意されています。

細胞タイプの制限: Tol2ベクターの細胞への導入はトランスフェクションに依存しますが、トランスフェクション効率は細胞タイプによって大きく異なります。非分裂細胞は分裂細胞よりも、また初代培養細胞はライン化された細胞よりも導入が困難です。さらに、神経細胞や膵臓β細胞などある種の細胞では、トランスフェクション法でのベクター導入は難しいことが知られています。

5' ITR: 5’末端逆向き反復配列。Tol2トランスポザーゼが両末端のITRを認識し、ITRとITR間にデザインされたDNA領域を宿主ゲノムに挿入します。

Promoter: 目的遺伝子を発現させるためのプロモーターをここに配置します。

Kozak: Kozakコンセンサス配列。真核細胞において翻訳開始を促進させるため、目的遺伝子ORFの開始コドン直前に配置します。

ORF: 目的遺伝子のOpen reading frameをここに配置します。

SV40 late pA: Simian virus 40後期ポリA付加シグナル。上流ORFの転写を終結させます。

3' ITR: Tol2の 3' 末端逆向き反復配列

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。