In vitro 転写ベクター(small RNA用)

概要

当社のin vitro転写ベクターはシンプルかつ効率的にRNAを生成することができ、様々な研究目的に利用できます。Small RNA用in vitro転写ベクターは生化学研究、shRNAノックダウン用途での細胞または胚へのインジェクション、CRISPR/gRNAによるゲノム編集、もしくは任意のsmall RNAが必要な実験などに理想的です。
当システムはバクテリオファージT7のRNAポリメラーゼ(T7 RNAP)とヌクレオチド三リン酸を適切な反応条件で使用して、目的配列の上流に配置されたT7プロモーターによって高率的なsmall RNA生成を可能にします。論文等で確立されているin vitro転写プロトコルを参考にして使用することをお勧めします。

T7 RNAPの効率的な転写開始のために必要となる塩基配列は既にベクター内に組み込まれています。T7プロモーターの3`末端の“GG”が目的配列の転写に伴ってmRNAの5`末端に付与されます。

当社のsmall RNA生成用in vitro転写ベクターはrun-off転写方式で設計されています。つまり、T7 RNAPはプラスミド内の特定の場所で転写を停止することなく、DNAテンプレートの最後まで転写を続けます。そのため、環状プラスミドを使う場合は、in vitro転写を実行する前に制限酵素(SapI)で切断、線状化する必要があります。SapIは当プラスミドの目的配列の下流を一度だけ切断します。目的配列にSapI認識配列が含まれていないことを確認してください、そうしないと分断されたsmall RNAが生成されます。制限酵素反応液からの混入物がT7 RNAP転写反応を阻害することがあるのでDNAカラムもしくはフェノール/クロロホルムによる抽出をおこなうことをお勧めします。T7プロモーター配列を持つ断片だけが転写のテンプレートになるので、通常はプロモーターと目的配列を含んだDNA断片を抽出する必要はありません。

多くのRNAタイプはin vivoで5‘末端でキャッピングと呼ばれる修飾を受けます。一般的にSmall RNAを利用する実験ではin vitro翻訳されたsmall RNAはキャッピングされていないほうが良い結果をもたらします。実験デザインを考慮に入れたうえで生成するsmall RNAに5‘キャップが必要かどうかを決めてください。もしキャッピングが必要な場合は、転写産物のキャップはキャップアナログを使用して転写と同時におこなうか、キャップ酵素を使って転写後におこないます。

当ベクターシステムのより詳細な情報については下記の論文を参照してください。

References Topic
Nucleic Acids Res. 7:1931 (1979) Cloning and characterization of the T7 promoter
Methods Mol Biol. 703:29 (2011) Protocols for the synthesis of RNA by in vitro transcription
Methods Mol Biol. 941:59 (2012) Preparation of short RNA by in vitro transcription
Protein Expr Purif. 9:142 (1997) Protocol for expression and purification of T7 RNAP for in vitro transcription

特徴

当社のsmall RNA用in vitro転写ベクターはT7 RNAPによって高効率なin vitro転写ができるように設計されています。当ベクターは高コピー数プラスミドであり、効果的な制限酵素分解、大量のsmall RNA生成ができるよう最適化されています。

メリット

高い効率: T7 RNAPは信頼性の高い、高効率な酵素です。T7 RNAPによるin vitro翻訳は大量のsmall RNAを生成可能です。

簡便さ:形質転換と細胞培養が必要な細胞内mRNA発現よりもT7 RNAPとプラスミドを使ったin vitro転写は簡便です。

デメリット

転写方向が限定的:当ベクターシステムはin vitro転写用にプロモーターをひとつだけ持ちます。T7プロモーターに対する目的配列の方向によって転写される配列が決まります。もしセンス・アンチセンスRNAの両方が必要ならば、2種類のベクターを作製する必要があります。
Run-off転写:当ベクターシステムを使用して効率の良いin vitro転写をおこなうためには、前処理として制限酵素によるプラスミドの線状化が必要です。

基本コンポーネント

T7 promoter: T7バクテリオファージ由来のRNAポリメラーゼ用プロモーター。下流の遺伝子の高レベル転写が可能。

Transcribed sequence: 生成したいRNA配列を持つDNAをここに配置する。

SapI:  In vitro翻訳反応の前処理としてプラスミドを線状化するときに利用する制限酵素サイト

pUC ori:  pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピー数で維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。