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Sleeping Beauty CAR (キメラ抗原受容体)発現ベクター

概要

将来性のあるガン治療法として、キメラ抗原受容体(chimeric antigen receptor:CAR)を利用して腫瘍関連抗原を認識するT細胞(CAR-T細胞)を作製する方法が注目されています。CAR-T細胞療法は患者本人から採取されたT細胞(自家的)もしくは健康なドナーから採取されたT細胞(同種的)にCARを発現させ、抗原への結合によって腫瘍細胞を標的としてT細胞が活性化するように設計します。

CARは4コンポーネントから構成されています。1) 細胞外抗原認識ドメイン。特異性が確認されているモノクローナル抗体由来の単鎖可変領域フラグメント(scFv)から構成される。scFvは抗原特異的モノクローナル抗体の可変領域の軽鎖と重鎖がリンカーペプチドで連結された構造をしている。2) 細胞外ヒンジ。scFVを膜貫通ドメインに連結してCARの安定性と柔軟性をもたらす。3) 膜貫通ドメイン。CARを細胞膜につなぎ留め、抗原結合ドメインと細胞内シグナルドメインの橋渡しをする。受容体の発現と安定性を高めるために重要な役割を果たす。4) 細胞内シグナルドメイン。T細胞受容体(TCR)のCD3-zetaドメイン由来でありITAMs(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)を内包している。ITAMsは抗原への結合とともにリン酸化されて下流シグナル伝達系を活性化してT細胞を活性化します。さらに細胞内シグナルドメインに複数の(CD28、CD137由来の)共刺激ドメインを加えることで、T細胞の増殖性と持続性を上昇させることができます。

CARは過去数年にわたる細胞内シグナルドメインの改良によって進化しています。第一世代CARはCD3-zeta シグナルドメインだけを持っていました。第一世代CARを発現するT細胞は活性化できるものの、細胞毒性と増殖率が低いためにin vivoでの抗腫瘍活性が貧弱でした。続いてCD3-zetaシグナルドメインに加えて共刺激ドメインを付加した第二世代CARの出現によって、CAR‐T細胞のin vivo増殖性、拡張性および持続性の大幅な改善をもたらしました。CD3-zetaドメインに加えて2つのシス共刺激ドメインを細胞内シグナルドメインに付加した第三世代CARは抗腫瘍活性をさらに改善しました。第二世代CARを基に開発された第四世代CARは恒常的もしくは誘導的にサイトカイン発現する様に改良した細胞内シグナルドメインをもちます。同様に第二世代CARを基に開発された第五および最新世代CARはサイトカイン受容体の細胞内シグナルドメインを組み込んでいます。

当社のsleeping beauty CAR発現ベクターはウイルスを利用しないで第二世代CAR発現カセットを哺乳類細胞に効果的に導入できます。当ベクターシステムは魚類のゲノムから同定され、変異によって活性を消失しているTc1/marinerスーパーファミリーのトランスポゾンを基に開発されました。サケ科魚類のTc1/marinerトランスポゾンからそれらの変異を取り除いて再構築したものがsleeping beautyトランスポゾンです。

sleeping beautyシステムは2種類のプラスミドベクター、トランスポゾンプラスミドとトランスポゼース発現ヘルパープラスミドから構成されます。トランスポゾンプラスミドには、トランスポーズされる領域の両脇に2つのIR/DR(R)が含まれています。トランスポゾンプラスミドとトランスポゼースが同時に細胞へ導入されると、2つのIR/DR(R)に挟まれた転移領域をゲノム中のTA配列に挿入します。配列挿入に伴ってTA配列が複製されて転移領域の両端に出現します。CAR発現カセット(scFV領域、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内CD3 zetaシグナルドメインと共刺激ドメインを含む)はIR/DR(R)のあいだにクローニングされます。トランスポゼースは、1)一過的なヘルパープラスミドのトランスフェクションもしくは、2)IVT (in vitro transcribed) mRNAを目的細胞へマイクロインジェクションする、2通りの方法でトランスポゾンを目的細胞にデリバリーできます。どちらの方法でも、トランスポゼースは短い間のみ発現します。ヘルパープラスミドの消失もしくはトランスポゼースmRNAの分解によってゲノムに挿入されたトランスポゾンは安定化します。

Sleeping Beautyは、カット&ペースト型のクラスIIトランスポゾンに分類され、自己コピーを残さずに転移します(クラスIトランスポゾンは、コピー&ペースト型で、自己コピーを残して転移します)。sleeping beautyヘルパープラスミドを再び導入することにより、ゲノムに痕跡を残すことなくsleeping beautyトランスポゾンを取り除くことができます。その際に転移の痕跡として複製されたTA配列に挟まれた3塩基配列が残されます。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
J Clin Invest. 130:6021 (2021) Using sleeping beauty engineered CAR T cells to achieve antileukemic activity
Br J Cancer. 120:26 (2019) Review on next-generation CAR T cells
Mol Ther Oncolytics. 3:16014 (2016) Review on CAR models
J Immunother. 32:689 (2009) Construction and pre-clinical evaluation of an anti-CD19 CAR
Mol Ther. 17:1453 (2009) In vivo characterization of chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains

特長

当社のsleeping beauty CAR発現ベクターは第二世代CARを発現できます。sleeping beautyトランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドはE.coliでの高コピー数複製、広範な標的細胞へ高効率なベクター導入および高い発現レベルを可能にします。

メリット

恒久的なゲノムへの挿入:sleeping beauty CAR発現ベクターはトランスポゾンを利用して宿主細胞ゲノムへの恒久的なCAR発現カセットの挿入、そしてT細胞の長期間にわたるCAR発現を可能にします。

簡便さ: sleeping beauty CAR発現ベクターはT細胞への導入に簡便なエレクトロポレーション法を使用します。一方で、ウイルスベクターはT細胞への導入前にパッケージング操作が必要なために技術の習熟と時間がかかります。

低コスト: 臨床グレードのsleeping beautyベクターの作成コストはウイルスベクターのコストと比べて非常に安くなるので、sleeping beautyを使ったCAR-T細胞の臨床開発はより高い費用対効果が得られます。CAR-T細胞治療の臨床効果をマウスモデルによる前臨床試験では予期することはできず、臨床試験で決定されるべきなので、CAR-T細胞治療の開発に大幅な利点となります

デメリット

エレクトロポレーション法の弊害:sleeping beauty CAR発現ベクターはエレクトロポレーション法によってT細胞に導入されます。CAR発現カセットが挿入された細胞が得られる効率は低~中程度となります。エレクトロポレーション法はT細胞にダメージを与え、機能的なCAR-T細胞の獲得数が減少させます。それゆえ、必要数をそろえるためにT細胞を長期間ex vivo培養する必要があり、時間経過とともに細胞の長期記憶が消失して表現型が変化する危険性があります。

転移可能なサイズが限定的: 1.9kbから7.2kbのサイズのDNA配列を転移できます。転移サイズが大きくなると効率が低下します。

基本コンポーネント

IR/DR(L): sleeping beautyトランスポゾンの左側inverted/direct repeat。sleeping beautyトランスポゼースによって認識され、IR/DR(L)とIR/DR(R)のあいだのDNA配列がTA配列に挿入される。

Promoter: CARを発現するプロモーター。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

CD8-leader: T細胞表面の糖タンパク質CD8 alphaドメインのシグナルペプチド。タンパク質のT細胞表面への輸送と局在に必要。

scFv: 特異性が確認されているモノクローナル抗体由来の単鎖可変領域フラグメント。抗原特異性にしたがって細胞を認識する。

Hinge: CARの細胞外ヒンジ領域。scFVと膜貫通ドメインを連結して、CARタンパク質発現と機能の安定性と柔軟性をもたらす。

Transmembrane domain: CARの膜貫通ドメイン。CARを細胞膜につなぎ留め、抗原結合ドメインと細胞内シグナルドメインの橋渡しをする。受容体の発現と安定性を高める。

Costimulatory domain: CARの共刺激ドメイン。CAR-T細胞の生存率、増殖率および活性化状態の持続性を上昇させる。

CD3zeta: T細胞受容体のCD3ζ鎖。T細胞による免疫反応を活性化する。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。CARの転写を停止する。

IR/DR(R): sleeping beautyトランスポゾンの右側inverted/direct repeat。

TATA: sleeping beautyトランスポゾンの転移効率を高める。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

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