Vector Systems
標準プラスミドgRNAセンサーベクター (gRNA特異性検査用)
概要
CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます（同様にZFNやTALENなどもよく利用されます）。
Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA（gRNA）と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。
gRNAセンサーベクターシステムは一つ以上のgRNAの標的配列に対してCRISPR/Cas9の切断効率をテストするために設計されています。複数のgRNA標的配列の中から最も効率的なCRISPR/Cas9の標的になりえる配列を特定することができます。
gRNAセンサーベクターシステムは強力な遍在性プロモーター（EF1A）の下流に設置される、２つに分割された不完全型EGFP（EGFP-LとEGFP-R）を利用しています。テストするgRNA標的配列はそれら不完全型EGFPのあいだにクローニングされます。EGFP-LはEGFPの始めの468bp、EGFP-Rは268‐720bpに相当する配列を持っています。EGFP-Lの3’側200bpとEGFP-Rの5‘側200bpは共通しています。
gRNAセンサーベクターだけが細胞に導入されても、EGFP-LとEGFP-Rはどちらも不完全なEGFPなので緑色蛍光を発することはありません。しかしgRNAとCas9がgRNAセンサーベクターと同時に細胞に導入されると、Cas9とgRNAはEGFP-LとEGFP-RのあいだのgRNA標的配列でgRNA-Cas9複合体を形成、DSB（double-stranded break）をつくりだします。DBSによってEGFP-LとEGFP-Rの相同配列のあいだの相同組み換えが可能になり、多くの場合、完全なEGFPが生み出され緑色蛍光を発するようになります。当システムは複数のgRNA標的配列（それぞれにPAM配列が必要）をEGFP-LとEGFP-Rのあいだにクローニングできます。それぞれの標的配列に対応するgRNAとCas9を導入することで、gRNA標的配列をひとつずつテストすることができます。緑色蛍光を発する細胞が現れる頻度を調べることで、定量的にCRISPR/Cas9効率を比較できます。
当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください
| References | Topic |
|---|---|
| Appl Biochem Biotechnol. 180:655 (2016) | Description of gRNA sensor system |
特長
当ベクターシステムは哺乳類細胞を使用した定量的なEGFPの蛍光観察によってgRNA標的配列に対するCRISPR/Cas9切断効率を比較できます。当システムは標準的なプラスミドベクターを使用しているので、高度な訓練の必要がなく簡便に利用できます。
メリット
簡単なテスト：シンプルかつ迅速にgRNA標的配列の切断効率テストが可能です。
高感度かつ信頼できる出力結果：強力なEF1Aプロモーターと信頼性の高いEGFP蛍光によって、たとえ非常に低いコピー数でも細胞の蛍光を検出できます。
簡便さ：パッケージングなどが必要なウイルスによる遺伝子導入と比べて、従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入は簡便です。
デメリット
単純化されたテスト: 当センサーベクターのgRNA標的配列はゲノム上の標的配列とは異なる状態にあり、細胞内で高コピー数存在します。そのため、当システムによって得られたCRISPR/Cas9切断効率は実際のものと比べて多少異なる可能性があります。
オフターゲット活性に関する情報は得られない: 当システムはgRNA標的配列に対するCRISPR/Cas9切断効率をテストしますが、オフターゲット活性についての情報は得られません。
基本コンポーネント
EF1A promoter: ヒト真核生物翻訳伸長因子１ アルファ１プロモーター。EGFP-L:gRNA Target:EGFP-R融合遺伝子を強力かつ恒久的に転写する。
Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。
EGFP-L: EGFP配列の1-468 bpに相当。蛍光タンパク質として不完全。
gRNA target sequence: テストしたいgRNA標的配列。複数のgRNA標的配列を直列にクローニング可能。それぞれのgRNA標的配列にPAM配列が必要。
EGFP-R: GFP配列の268-720bpに相当。蛍光タンパク質として不完全。
SV40 late pA: SV40（Simian virus 40）のlateポリアデニレーションシグナル。上流マーカー遺伝子の転写を停止する。
CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。
Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）、視覚化用遺伝子（mCherryなど、緑色蛍光タンパク質は避けること）、デュアルレポーター遺伝子（mCherry/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。
BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。
pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。
Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。