低リーク型標準プラスミドTet-On誘導性遺伝子発現ベクター

概要

Tet-On誘導性遺伝子発現システムは哺乳類細胞で目的遺伝子の発現タイミングを制御できる強力なツールです。当社のTet-On誘導性遺伝子発現ベクターはテトラサイクリン(もしくはドキシサイクリンなどのアナログ)非存在条件下のほぼ完全な遺伝子発現抑制とテトラサイクリンの添加に応じた目的遺伝子の強力かつ素早い発現誘導を実現します。当システムはテトラサイクリン非存在下のtTSタンパク質による能動的な発現抑制効果とテトラサイクリン存在下のrtTAタンパク質による強力な発現誘導効果が組み合わされています。TetR(Tet抑制タンパク質)とKRAB-AB(Kid1タンパク質の転写抑制ドメイン)の融合タンパク質であるtTSはテトラサイクリン非存在条件でTREプロモーターに結合し、遺伝子の転写を抑制します。一方で、Tet抑制タンパク質の変異体とVP16(単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質の転写活性化ドメイン)との融合タンパク質であるrtTAはテトラサイクリン存在条件でTREプロモーターに結合して遺伝子の転写を活性化します。

当社の標準プラスミドTet-On誘導性遺伝子発現ベクターは遺伝子の転写活性化スイッチとしてtTSとrtTAを融合タンパク質として発現します。低リーク型標準プラスミドTet-On誘導性遺伝子発現ベクターはテトラサイクリン非存在条件下で非標的組織における発現漏れを最小限にしつつ、目的遺伝子の組織特異的な発現を可能にします。当ベクターには3種類の遺伝子発現カセットがあります。1)TREプロモーターによって発現される目的遺伝子。2)遍在的プロモーターによって発現されるtTS。3)任意の組織特異的プロモーターによって発現されるrtTA。テトラサイクリン非存在条件下でtTSはすべての組織で発現、TREプロモーターに結合することで目的遺伝子の発現を抑制します。テトラサイクリン存在条件下ではrtTAが標的組織のみで発現、TREプロモーターに結合することで目的遺伝子を標的組織特異的に発現します。

当ベクターの哺乳類細胞への導入は従来の遺伝子導入法を利用しています。近年はレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクターやPiggyBac等の優れた遺伝子導入法が開発されていますが、従来通りのプラスミドベクターによる遺伝子導入法は技術的に容易であることと多くの細胞タイプにおいて十分な効率が得られるために、現在でも多くのラボで利用されています。プラスミドベクターによる遺伝子導入は一過性であり非常に少数の細胞(大抵は1%以下)でのみプラスミドのゲノムへの挿入が起こります。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Science. 286:1766 (1995) Development of rtTA.
J Gene Med. 1:4 (1999) Development of tTS
Semin Cell Dev Biol. 13:121 (2002) Review on Tet-based systems

特徴

当社の低リーク型Tet-On誘導性遺伝子発現システムはテトラサイクリン非存在条件での目的遺伝子のほぼ完全な発現抑制と、テトラサイクリン添加に応答した強力かつ素早い発現誘導を可能にします。低リーク型Tet-On誘導性遺伝子発現ベクターはテトラサイクリン存在条件での非標的組織における発現漏れを最小限におさえつつ、目的遺伝子の組織特異的な発現を可能にします。当ベクターはE.coliでの高コピー数複製と多くの哺乳類細胞株に対する高い導入効率を実現しています。

メリット

厳密な遺伝子発現の活性化:rtTAのみを利用した従来のTet-Onシステムは誘導条件でなくても無視できないレベルの発現漏れが存在します。非誘導条件での発現漏れを最小限にし、幅広いテトラサイクリン濃度に高感度で応答できる当社のTet-On誘導性遺伝子発現システムはテトラサイクリンによって遺伝子発現を厳密にon/offできます。

標的ではない組織での発現漏れを最小限に抑える:低リーク型Tet-On誘導性遺伝子発現ベクターは遍在的なCBhプロモーターを使用してtTSタンパク質を発現します。tTSタンパク質はテトラサイクリン非存在条件でTREに結合して標的組織以外の部位における目的遺伝子の発現を抑制します。

組織特異的な発現誘導: 低リーク型Tet-On誘導性遺伝子発現ベクターは標的組織における特異的なテトラサイクリンによる発現誘導を実現するために任意の組織特異的プロモーターを選択して使用できます。

簡便さ:プラスミドベクターは従来の方法によって細胞に導入されます。パッケージング操作が必要なウイルスと比べると非常に簡便です。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のベクターは全体で~30kbのDNA配列を扱うことができます。当ベクターのバックボーン部分(Tet-Onコンポーネント含む)は5.2kbほどですので、残りを目的遺伝子やTet制御タンパク質発現用プロモーターなどの任意の目的で使用することができます。

高レベル発現: TREプロモーターは誘導条件下で高レベルの遺伝子発現を可能にします。プラスミドによる遺伝子導入はしばしば非常に高いコピー数(数千コピー)が細胞に導入されることにより、高い発現量をもたらします。

デメリット

ベクターDNAがゲノムへ挿入されない:従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法はベクターのほとんどが宿主ゲノムへ挿入されずにエピソームDNAとして維持されるために、ベクターは細胞内で短い期間のみ維持されます。非常に低い頻度ですが(細胞タイプによって102-106細胞あたり1回)、ベクターの宿主ゲノムへ挿入が起こります。薬剤耐性や蛍光マーカーがプラスミドベクターに組み込まれているならば、薬剤選択やセルソーターによって挿入が起こった細胞を選別できます。

使用できる細胞タイプが限定される:細胞タイプによってベクターの導入効率は大きく異なるので、利用できる細胞タイプは限定されます。一般的に非増殖細胞は増殖細胞よりも形質転換効率は低く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも形質転換が困難です。神経細胞や脾臓β細胞などの形質転換は非常に難しくなります。加えて、ベクターの導入はin vitro実験に限定され、in vivo用途にはほとんど利用されません。

導入コピー数にばらつきが大きい:細胞あたりに導入されるベクターの平均コピー数は非常に高くなりますが、ばらつきが大きくなります(ある細胞は非常に高コピー数だが、別の細胞は数コピーしかない、等)。一方でウイルスによる遺伝子導入法はこのようなばらつきは小さくなる傾向があります。

基本コンポーネント

TRE promoter: テトラサイクリン応答性プロモーター(第二世代)。その活性化はテトラサイクリンもしくはそのアナログ(ドキシサイクリンなど)に依存し、転写因子群(tTA、rtTA、tTS)による制御を受ける。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 発現させたい目的遺伝子。

rBG pA: ラビットβ-グロブリンポリアデニレーションシグナル。目的遺伝子の転写を停止する。

Promoter: rtTAを発現させる組織特異的プロモーター。

rtTA: 逆テトラサイクリン応答性転写活性化因子M2 (第二世代)。テトラサイクリン(またはドキシサイクリン)に応答してTREプロモーターに結合、遺伝子転写を活性化させる。前世代よりもテトラサイクリン非存在下の発現漏れが低く、低濃度での誘導が可能になった。

CBh promoter: CMV earlyエンハンサーが付加されたチキン β‐アクチンプロモーター。下流のtTSタンパク質を発現する。

tTS: テトラサイクリン応答性転写抑制因子。テトラサイクリン及びそのアナログ(ドキシサイクリンなど)非存在下でTREプロモーターに結合し、遺伝子転写を抑制する。

SV40 late pA: SV40(Simian virus 40)のlateポリアデニレーションシグナル。tTSタンパク質の転写を停止する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。