標準プラスミドnon-coding RNA発現ベクター

概要

標準プラスミドnon-coding RNA発現ベクターは様々な哺乳類動物細胞に対してnon-coding RNA発現カセットを効率的に導入できます。Non-coding RNAは多種のshort(30塩基以下)もしくはlong(200塩基以上)機能性RNA分子を含みます。micro RNAs (miRNAs)、small interfering RNAs (siRNAs)、piwi-interacting RNAs (piRNAs)、small nuclear RNAs (snRNAs)、small nucleolar RNAs (snoRNAs)、large intergenic non-coding RNAs (lincRNAs)、intronic long non-coding RNAs (intronic lncRNAs)、natural antisense transcripts (NATs)、enhancer RNAs (eRNAs) 、 promoter-associated RNAs (PARs)などの機能性RNAがあります。これらはタンパク質に翻訳されることはありませんが、DNA複製、エピジェネティック制御、転写および転写後制御そして翻訳制御など数多くの細胞内機構で重要な役割を担っています。

標準プラスミドnon-coding RNA発現ベクターはRNAポリメラーゼⅡプロモーターを使用してnon-coding RNAを発現するように設計されているので、組織特異的、誘導性もしくは様々な活性強度を持つプロモーターを使用した多様な実験用途に対応できます。RNAポリメラーゼⅡプロモーターによる転写反応はプロモーターの3‘域から始まり、ポリAシグナル配列内で終了します。そのため、当ベクターから生産されるnon-coding RNAとオリジナルのnon-coding RNAの配列は正確に一致せず、上流と下流にいくつかの配列が追加されます。

当ベクターの哺乳類細胞への導入は従来の遺伝子導入法を利用しています。近年はレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクターやPiggyBac等の優れた遺伝子導入法が開発されていますが、従来通りのプラスミドベクターによる遺伝子導入法は技術的に容易であることと多くの細胞タイプにおいて十分な効率が得られるために、現在でも多くのラボで利用されています。プラスミドベクターによる遺伝子導入は一過性であり非常に少数の細胞(大抵は1%以下)でのみプラスミドのゲノムへの挿入が起こります。

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Cell. 157:77 (2014) Review on non-coding RNAs
Front Genet. 6:2 (2015) Review on functionality of non-coding RNAs
Oncogene. 30:4750 (2011) Regular plasmid mediated expression of long non-coding RNA

特徴

標準プラスミドnon-coding RNA発現ベクターはE.coliでの高コピー数複製と高いnon-coding RNA発現カセットの導入効率を実現しています。また、ベクターが導入された細胞をマーカー遺伝子の発現による薬剤選択もしくは可視化によって選別することができます。

メリット

簡便さ:パッケージングなどが必要なウイルスによる遺伝子導入と比べて、従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法は簡便です。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のベクターは全体で~30kbのDNA配列を扱うことができます。当ベクターのバックボーン部分は3kbほどですので、残りを任意の目的で使用することができます。

高レベル発現:従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法はしばしば非常に高いコピー数(数千コピー)を細胞に導入できます。これらの細胞は非常に高いnon-coding RNAの発現量を持ちます。

デメリット

ベクターDNAがゲノムへ挿入されない:従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法はベクターのほとんどが宿主ゲノムへ挿入されずにエピソームDNAとして維持されるために、ベクターは細胞内で短い期間のみ維持されます。非常に低い頻度ですが(細胞タイプによって102-106細胞あたり1回)、ベクターの宿主ゲノムへ挿入が起こります。薬剤耐性や蛍光マーカーがプラスミドベクターに組み込まれているならば、薬剤選択やセルソーターによって挿入が起こった細胞を選別できます。

使用できる細胞タイプが限定される:細胞タイプによってベクターの導入効率は大きく異なるので、利用できる細胞タイプは限定されます。一般的に非増殖細胞は増殖細胞よりも形質転換効率は低く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも形質転換が困難です。神経細胞や脾臓β細胞などの形質転換は非常に難しくなります。加えて、ベクターの導入はin vitro実験に限定され、in vivo用途にはほとんど利用されません。

導入コピー数にばらつきが大きい:細胞あたりに導入されるベクターの平均コピー数は非常に高くなりますが、ばらつきが大きくなります(ある細胞は非常に高コピー数だが、別の細胞は数コピーしかない、等)。一方でウイルスによる遺伝子導入法はこのようなばらつきは小さくなる傾向があります。

基本コンポーネント

Promoter: non-coding RNAを発現するプロモーター。

Non-coding RNA: 実験に使用するnon-coding RNA。

SV40 late pA: SV40(Simian virus 40)のlateポリアデニレーションシグナル。上流non-coding RNAの転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子(ネオマイシン耐性など)や視覚化用遺伝子(EGFPなど)、もしくはデュアルレポーター遺伝子(EGFP/Neoなど)。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。マーカー遺伝子の転写を停止する。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。