標準プラスミドCas9発現ベクター

概要

CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます(同様にZFNやTALENなどもよく利用されます)。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA(gRNA)と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

CRISPRによる遺伝子ターゲティングには細胞内で標的配列特異的なgRNAとCas9が共発現している必要があります。Cas9とgRNAをひとつのベクター(all-in-oneベクター)から発現させるか、Cas9とgRNAをそれぞれ独立したベクターから発現させることによって共発現が可能になります。Cas9とgRNAの発現に独立したベクターを使うメリットは、実験目的に応じて様々なgRNAとCas9(野生株Cas9、ニッケース、不活性型Cas9など)を柔軟に組み合わせて使用できる点です。

当社の標準プラスミドCas9発現ベクターは従来の遺伝子導入法を使用して高い効率で哺乳類動物細胞にCas9を導入します。近年はレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクターやPiggyBac等の優れた遺伝子導入法が開発されていますが、従来通りの方法は技術的に容易であることと多くの細胞タイプにおいて十分な効率が得られるために、現在でも多くのラボで利用されています。標準プラスミドベクターによる遺伝子導入は一過性であり非常に少数の細胞(大抵は1%以下)でのみプラスミドのゲノムへの挿入が起こります。

当社のCas9コレクションは複数のSpCas9(Streptococcus pyogenes由来のCas9)バリアントを用意しており、当社のオンラインポータルを利用して任意のCas9発現ベクターを容易に設計できます。Cas9バリアントとして、1)ヒトコドン使用頻度に最適化され、効率的なDSB(double-strand breaks)生成が可能なhCas9、2)DNAの一本鎖切断(ニック)のみを生成するhCas9ニッケース変異体hCas9-D10A、3)D10AとH840A変異を持つ不活性型hCas9であるdCas9、4)オフターゲット活性を減少させ、特異性を高めたSpCas9-HF1とeSpCas9を用意しています。加えて、dCas9と転写活性化ドメインの融合タンパク質であるdCas9/VP64、dCas9/VPR(CRISPRa用途)や転写抑制ドメインの融合タンパク質dCas9/KRAB(CRISPRi用途)も利用できます。その他にも、遺伝子サイズの小さいCas9バリアントが必要ならばStaphylococcus aureus由来のSaCas9や、DSB後に突出末端を生成するAcidaminococcus 由来のAsCpf1が用意されています。

Cas9コレクションの詳細についてはこちらから

 

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Science. 339:819 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Nat. Biotech. 31:827 (2013) Specificity of RNA-guided Cas9 nucleases
Nat. Commun. 9:1911 (2018) Review on various Cas9 variants

特徴

当社の標準プラスミドCas9発現ベクターは高レベルのCas9発現と標的配列特異的なgRNAによる高効率のCRISPRターゲッティングを可能にします。実験目的に応じて数々のCas9バリアントが用意されています。標準プラスミドCas9発現ベクターはE.coliでの高コピー数複製と高い遺伝子導入効率を達成しており、当ベクターで形質転換された細胞はマーカー遺伝子によって薬剤選択もしくは可視化できます。

メリット

一過的な発現:Cas9発現ベクターはCas9を強力かつ一過的に発現します。ゲノム編集が完了した後は薬剤選択を停止することでプラスミドは時間経過とともに失われ、同時にCas9タンパク質も標的細胞から失われます。

柔軟性:Cas9発現ベクターは様々な標的配列に対するgRNA発現ベクターと組み合わせて同時に使用できます。

簡便さ:パッケージングなどが必要なウイルスによる遺伝子導入と比べて、従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入は簡便です。

高レベル発現:従来のプラスミドによる遺伝子導入法は細胞へ非常に高コピー数(細胞あたり数千コピー)の遺伝子導入が可能なため、高レベルのCas9発現が可能です。

デメリット

ベクターDNAがゲノムへ挿入されない:従来のプラスミドによる遺伝子導入法はプラスミドベクターのほとんどがエピソームDNAとして維持されるために、ベクターは細胞内で短期間のみ維持されます。しかし、非常に低い頻度ですが(細胞タイプによって102-106細胞あたり1回)宿主ゲノムへ挿入が起こります。薬剤耐性や蛍光マーカーがプラスミドベクターに組み込まれているならば、薬剤選択やセルソーターによって挿入が起こった細胞を選別できます。

細胞タイプが限定される:標準プラスミドCas9発現ベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。非増殖細胞は一般的に増殖細胞よりも効率が悪く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。プラスミドによる遺伝子導入はin vitro用途に限定され、in vivo用途にはほとんど使用されません。

導入コピー数にばらつきが大きい:細胞あたりに導入されたベクターの平均コピー数は非常に高くなりますが、ばらつきが大きくなります(ある細胞は非常に高コピー数ですが、別の細胞は数コピーしかない、等)。一方でウイルスによる遺伝子導入法はこのようなばらつきは小さくなる傾向があります。

PAMが必要:CRISPR/Cas9システムはgRNA標的配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。PAMはCas9バリアントによって異なります。

基本コンポーネント

Promoter: Cas9発現用プロモーター。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: Cas9バリアントの遺伝子。

SV40 late pA: SV40(Simian virus 40)のlateポリアデニレーションシグナル。上流マーカー遺伝子の転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子(ネオマイシン耐性など)、視覚化用遺伝子(EGFPなど)、デュアルレポーター遺伝子(EGFP/Neoなど)。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。