PiggyBac shRNAノックダウンベクター

概要

当社のpiggyBac shRNAノックダウンベクターシステムは広範な細胞タイプで標的遺伝子の発現をシンプルかつ効率的、そして安定してノックダウンできます。当システムはトランスポゾンを基に開発されており、ウイルスを利用しないプラスミドによる遺伝子導入によって恒久的にshRNA発現カセットを宿主ゲノムへ挿入できます。shRNAはヒトU6プロモーターから発現され、標的遺伝子mRNAを分解します。PiggyBacシステムによる恒久的なノックダウン効果は人工合成siRNAに対して明らかな優位性を持ちます。

PiggyBac shRNAノックダウンベクターシステムはE.coliプラスミドとして設計された2つのベクターから構成されます。ひとつめはヘルパープラスミドとよばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、2つのITR(inverted terminal repeats)のあいだにshRNA発現カセットを持ちます。

ヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドが標的細胞に同時導入されると、ヘルパープラスミドから発現したトランスポゼースはトランスポゾンプラスミド上の2つのITRを認識してITRとshRNA発現カセットを宿主ゲノムへ挿入します。piggyBacはクラスIIトランスポゾンであり、カット&ペースト様式(転移後に自身のコピーを残さない)で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー&ペースト様式をとります。ヘルパープラスミドは一過的に細胞内に導入され、時間経過とともに失われます。ヘルパープラスミドの宿主細胞からの消失によってゲノムへ挿入されたトランスポゾンは恒久的に固定化されます。ヘルパープラスミドが再導入された場合、トランスポゾンはゲノムの挿入位置から再び転移することがあります。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

References Topic
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011) Review
Cell. 122:473 (2005) Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice

特徴

当社のPiggyBac トランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドはE.coliでの高コピー数複製、広範な細胞タイプへの高効率な遺伝子導入を実現します。ヒトU6プロモーターは哺乳類細胞内でshRNAを高レベルかつ恒久的に発現させ、当社のshRNA ステムループ配列は効率的なshRNAの折りたたみと標的遺伝子のノックダウンのために最適化されています。

メリット

恒久的なゲノムへの挿入とノックダウン効果:従来の方法で宿主細胞へ導入された遺伝子は時間経過とともに失われてしまいます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。一方でPiggyBacトランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドを使った遺伝子導入法はトランスポゾンがDNA配列を恒久的に宿主ゲノムへ挿入します。さらに、ヒトU6プロモーターがshRNAを恒久的に発現します。そのため、標的遺伝子のノックダウン効果は安定して恒久的なものになります。これは長期間にわたるノックダウンによる表現型の観察など、多くの実験にとって重要な利点となります。また、ノックダウンベクターにEGFPなどの蛍光マーカーを組み込むことで、蛍光強度の違いを利用してFACSによるトランスポゾン挿入コピー数が異なる細胞の単離が可能になります。これによって様々なノックダウンレベルおよび表現型を持つクローンを単離できます。

可逆性:PiggyBac shRNAトランスポゾンが挿入された細胞に対してヘルパープラスミドを再導入することによって、トランスポゾンをゲノムから取り除いてshRNA発現を停止させることができます。しかしながら、トランスポゾン除去は一部の細胞のみで起こるのでスクリーニングが必要になります。

簡便さ:パッケージングなどが必要なウイルスによる遺伝子導入と比べて、従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法は簡便です。

安全性:従来の遺伝子導入法をもちいるため、ウイルスベクターに関連する危険とは無縁です。

デメリット

細胞タイプが限定される:PiggyBacベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。非増殖細胞は一般的に増殖細胞よりも効率が悪く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。プラスミドによる遺伝子導入はin vitro用途に限定され、in vivo用途にはほとんど使用されません。これはPiggyBacシステムにも当てはまります。

基本コンポーネント

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。piggyBacトランスポゼースは2つのITR(5' ITR と3' ITR)を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

U6 promoter: ヒトU6 snRNAのプロモーター。RNAポリメラーゼIIIによってshRNAを高レベルで発現する。

Sense, Antisense: 標的配列から設計され、shRNAのヘアピン構造のステム部分を形成する。

Loop: shRNAのヘアピン構造のループ部分を形成するために最適化された配列。

Terminator: shRNAの転写を停止する。

hPGK promoter: ヒトphosphoglycerate kinase 1 遺伝子プロモーター。下流のマーカー遺伝子を遍在的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子(ネオマイシン耐性など)、視覚化用遺伝子(EGFPなど)、デュアルレポーター遺伝子(EGFP/Neoなど)。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

rBG pA: ラビットβ-グロブリンポリアデニレーションシグナル。上流マーカー遺伝子の転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。 E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。