PiggyBac miR30型shRNAノックダウンベクター

PiggyBac miR30型shRNAノックダウンベクターは哺乳類細胞においてシンプルかつ効率的に標的遺伝子の発現をノックダウンできます。当システムは従来のプラスミドベクターを利用して、任意の遺伝子と複数のmiR30型shRNA(shRNAmiR)を含むポリシストロニック発現カセットを哺乳類細胞に導入します。shRNAmiR転写物は宿主細胞のmiRNA経路によって機能性shRNAへと変換されて標的遺伝子mRNAの分解を促進します。PiggyBacシステムによる恒久的なノックダウン効果は人工合成siRNAによる一過性のノックダウンに対して明らかな優位性を持ちます。

PiggyBac miR30型shRNAノックダウンベクターシステムはE.coliプラスミドとして設計された2つのベクターから構成されます。ひとつめはヘルパープラスミドと呼ばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、２つのITR（inverted terminal repeats）のあいだにポリシストロニック発現カセットを持ちます。ヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドが標的細胞に同時導入されると、ヘルパープラスミドから発現したトランスポゼースはトランスポゾンプラスミド上の2つのITRを認識してITRとポリシストロニック発現カセットを宿主ゲノムへ挿入します。piggyBacトランスポゾンはゲノムのTTAA配列に挿入されます。挿入の過程でTTAA配列は複製されて挿入場所の両端に配置されます。

U6のようなRNAポリメラーゼⅢプロモーターを利用する従来のshRNAベクターと異なり、miR30型shRNAはRNAポリメラーゼⅡによって発現されます。そのため組織特異性、誘導性、または転写活性の異なるプロモーターなどを利用して、恒久的に発現するU6プロモーターではできなかった実験条件が可能になります。

大きなサイズの転写産物を生産できるRNAポリメラーゼⅡは他のノックダウンベクターシステムにはない利点をもたらします。複数のshRNAmiRsを含んだポリシストロンを転写して、複数のshRNAを細胞内で同時生産することができます。これによって一つの転写産物から複数の標的遺伝子のノックダウンを実行したり、一つの遺伝子の複数部位を標的とすることでノックダウン効率を高めたりすることが可能になります。当社ではシングルshRNAとマルチshRNA発現用ベクターが用意されています。さらに、当ベクターに任意の遺伝子をshRNAmiRsと共にポリシストロンに組み込むことも可能です。この遺伝子をマーカーとして使うことでshRNA転写効率のモニターや遺伝子とshRNAの共発現が必要になる実験に利用できます。

PiggyBacはクラスIIトランスポゾンであり、カット＆ペースト様式（転移後に自身のコピーを残さない）で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー＆ペースト様式をとります。ヘルパープラスミドは一過的に細胞内に導入され、時間経過とともに失われます。ヘルパープラスミドの宿主細胞からの消失によってゲノムへ挿入されたトランスポゾンは恒久的に固定化されます。ヘルパープラスミドが再導入された場合、トランスポゾンはゲノムの挿入位置から再び転移することがあります。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

PiggyBac miR30型shRNAノックダウンベクターは遺伝子ノックダウンのために最適化されたmiRNAシステムが組み込まれています。当ベクターとヘルパープラスミドはE.coliでの高コピー数複製、広範な標的細胞へ高効率なベクター導入および高い発現レベルを可能にします。任意のプロモーターによって任意の遺伝子と複数shRNAmiRsをポリシストロニック転写産物として発現できます。shRNAmiRsは効率的なshRNA生産と標的遺伝子のノックダウンを実現する、最適化されたmiR30配列を持ちます。

プロモーターが選択可能: U6のようなRNAポリメラーゼⅢプロモーターを利用するshRNAシステムとは異なり、当システムではRNAポリメラーゼⅡ用プロモーターが採用されています。そのため、組織特異性プロモーターや誘導性プロモーターなどを利用してmirR30型shRNAを発現できます。

複数shRNA同時発現：RNAポリメラーゼⅡは大きなサイズのRNAを転写することができるので、単一プロモーターから複数shRNAmiRをポリシストロンとして発現させることができます。シングルshRNAとマルチshRNA発現用ベクターが用意されています。

レポーター遺伝子の共発現：任意の遺伝子もしくはレポーター遺伝子をshRNAmiRと共にポリシストロンとして発現することができます。レポーター遺伝子はshRNA転写量モニタリングに利用できます。

恒久的なゲノムへの挿入とノックダウン効果：従来の方法で宿主細胞へ導入された遺伝子は時間経過とともに失われてしまいます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。一方でPiggyBacトランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドを使った遺伝子導入法はDNA配列を恒久的に宿主ゲノムへ挿入します。そのため、標的遺伝子のノックダウン効果は安定して恒久的なものになります。これは長期間にわたるノックダウンによる表現型の観察など、多くの実験にとって重要な利点となります。また、ノックダウンベクターにEGFPなどの蛍光マーカーを組み込むことで、FACSによる蛍光強度の違いを利用したトランスポゾン挿入コピー数が異なる細胞の単離が可能になります。これによって様々なノックダウンレベルおよび表現型を持つクローンを単離できます。

可逆性：PiggyBac shRNAトランスポゾンが挿入された細胞に対してヘルパープラスミドを再導入することによって、トランスポゾンをゲノムから取り除いてshRNA発現を停止させることができます。しかしながら、トランスポゾン除去は一部の細胞のみで起こるのでスクリーニングが必要になります。

簡便さ：パッケージングなどが必要なウイルスによる遺伝子導入と比べて、従来のプラスミドベクターによる遺伝子導入法は簡便です。

安全性：従来の遺伝子導入法をもちいるため、ウイルスベクターに関連する危険とは無縁です。

細胞タイプが限定される：PiggyBacベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。非増殖細胞は一般的に増殖細胞よりも効率が悪く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。プラスミドによる遺伝子導入はin vitro用途に限定され、in vivo用途にはほとんど使用されません。これはPiggyBacシステムにも当てはまります。

PiggyBac シングルmiR30型shRNAノックダウンベクター

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。piggyBacトランスポゼースは2つのITR（5' ITR と3' ITR ）を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

Promoter: 下流の遺伝子とshRNAmiR をポリシストロンとして転写する。U6のようなRNA polymerase III ではなくRNA polymerase IIプロモーターが使われる。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: 任意の遺伝子もしくはレポーター遺伝子を配置する。shRNA発現モニタリングにも利用可能。

5' miR-30E: 最適化されたヒトmiR30　5’関連配列。shRNAプロセシングと成熟、そしてポリシストロンからの切断分離を促進する。

3' miR-30E: 最適化されたヒトmiR30　3’関連配列。shRNAプロセシングと成熟、そしてポリシストロンからの切断分離を促進する。

miR30-shRNA: ノックダウン標的配列から設計され、shRNAヘアピン構造のステム部分を形成する。

rBG pA: ラビットβ-グロブリンポリアデニレーションシグナル。上流遺伝子とshRNAmiRのポリシストロン転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）、視覚化用遺伝子（EGFPなど）、デュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

PiggyBac マルチmiR30型shRNAノックダウンベクター